Thermostimulator TSA II를 사용하여 열 통증 테스트 1. 소개 <ol><li> 이 절차는 TSA II, thermode (메독 고급 의료 장비, 더럼, NC)로 피부에 열 자극을 제공하는 상용 온도 감각 분석기를 사용합니다. 중앙 단위는 thermode 신호를 생성하고 전송합니다. 이 신호는 일반적으로 중앙 단위에 연결된 컴퓨터에 저장되어 독점 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 또한 연구 대상이 thermode의 가열을 중지 수있는 휴대용 제어하는​​ 중앙 장치에 첨부​​하여 보내드립니다. </li><li> 세븐 순차와 동일한 열 자극은 30의 상호 자극 간격으로 전달됩니다. 기초 thermode 온도는 편안하게 35 º C.에서 설정됩니다 thermode가 가열하는 속도는 1으로 설정됩니다 º C / S, 그것이 아래로 냉각하는 속도가 10 º C / s의에서 설정되는 동안 최대 thermode 온도가 52 º C.에서 설정됩니다 </li></ol> 2. 준비 및 교육 과목 <ol><li> 머리, 팔, 다리에 대한 적절한 지원을 제공합니다 reclining 의자에 편안하게 열 통증 시험 좌석 그들을위한 과목을 준비합니다. 의자는 또한 검사 신체 사이트에 쉽게 액세스를 허용해야합니다. </li><li> 시험 시설 편안한 상온에서 수 있으며, 노 산만과 꽤하고 중립적인 환경을 제공해야합니다. </li><li> 실험을 시작하기 전에, 모든 참가자가 잘 열 고통 테스트의 모든 측면에서 훈련해야합니다. 교육은 실험하기 전에 언제든지 장소 걸릴 수 있습니다. </li><li> 학습 과목과 조사관 사이의 상호 작용은 데이터를 수집하기 위해 필요한 사람으로 제한해야합니다. 그들은 데이터 일관성을 손상시킬 수 있기 때문에 농담과 잡담은 낙담하고 있습니다. 학습 과목은 상호 작용이 의도적으로 실험 기간 동안 다소 monotonic하고 중립적인 것으로 알려 있습니다. </li><li> 지시 사항은 명확 단순하고 일관성 유지. 그 고통은 주관적이며, 권리 또는 잘못 대답이 없다는 점이다. 그것은 일관되게 가장 중요합니다. &quot;에 대한 고통으로&quot;존재와 사이의 지점으로 열 통증 임계값을 정의 &quot;단지 통증이되었습니다.&quot; </li><li> 그것은 피사체가 테스트 세션 동안 기대해야하는지 정확하게 알고있다 중요합니다. 이러한 불안과 같은 confounders가 생성되었을 수 있기 때문에 모든 &quot;놀라운&quot;적은 일관성있는 데이터가 발생할 수 있습니다. 일곱 열 통증 자극이 열 통증 임계값을 결정하는 데 사용하는 경우 예를 들어, 주제는 이것을 알아야합니다. </li><li> 언제든지 주제 휴대용 컨트롤의 버튼을 누른다하여 섹시한 받기에서 thermode를 중지할 수 있습니다. 컨트롤에있다는 것은 주제의 불안을 감소하고 데이터를보다 안정하게됩니다. </li><li> 교육 세션은 연구 대상의 성능을 판단할 수있는 기회를 제공하고 있습니다. 그것은 그들의 개인적인 고통 임계값이 더 이상 0.8 이상 ° C, 그리고 이상적으로 더 이상 0.6 이상에서 ° 마지막 두 테스트 사이클 사이에 C.에 따라 다를 수 있으므로 2-4 테스트주기 동안 과목을 양성하는 것이 가장 좋습니다 지속적으로 수행하지 않는 과목은 일반적으로 연구에서 제외됩니다. </li></ol> 3. 고통 임계값 결정 <ol><li> 시작하려면 고통 임계값 테스트 사이클이 주제의 피부에 thermode의 위치를​​ 표시합니다. 이 실험에서 microdialysis에 사용된 것과 같은 염증 피부 병변은 통증 테스트에 대한 응답으로 릴리즈 biochemicals에 대해 배울 고통에 대해 테스트됩니다. </li><li> 그런 다음, 표시된 피부 지역에 thermode를 삽입하여 각 사이클을 시작합니다. 가능한 한 가깝게으로 표시와 함께 thermode의 위치를​​ 일치시킵니다. 피부와 thermode 사이의 온도가 35 평형 수 있도록 허용 ° C - 안전, 고통의 원인이되지 않습니다 온도. 이 5 초 정도 걸립니다 그리고 컴퓨터 화면에 35 ° C의 독서로 표시됩니다. </li><li> 시작하기 전에 주제 휴대용 제어를 제공합니다. </li><li> 테스트하는 동안 대상의 피부와 접촉하는 모든 thermode의 전체 표면을 유지하기 위해 지속적인 부드러운 압력을 사용하십시오. </li><li> 이제 미리 프로그램된 테스트 알고리즘을 시작합니다. thermode 1에서 가열 시작 ° C / s의 마자 피사체 경험 고통, 그들은 손에 개최 장치를 누르십시오됩니다. </li><li> 휴대용 장치에있는 버튼을 눌러 후, thermode 온도 원인이 통증이 자동으로 등록되며 ° ~ 35 자사의 기준 온도로 C / S 다운 ° C. 10 비율로 감소하기 시작합니다 </li><li> 가 1에서 다시 상승 시작하기 전에 온도 프로브는 자동으로 30 S 35 ° C에 보관됩니다 ° 피사체가 다시 휴대용 장치의 버튼을 못살게 굴지 때까지 C / S,. thermode 온도가 다시 증가에 대한되기 전에,이에 대한 일이되는 주제를 상기. 이것은 피사체가 초점을 유지합니다. </li><li> 일곱 온도 기록이 등록되어 때까지이 순서가 반복됩니다. 이러한 템피의 평균을 계산rature의 수치는, 이것은 열 고통 임계값입니다. </li></ol> 첨부터 끝까지 압력 프로브와 함께 기계적 통증 테스트 1. 소개 <ol><li> 그들이 전통적으로 사용하고 상용 폰 프라이 머리카락보다 일관성있는 결과를 제공하기 때문에, 사용자 정의 만든 보정 첨부터 압력 프로브를 사용합니다. 프로브는 넓은 내에서 자유롭게 이동할 다양한 가중치의 구리 막대에 장착된 동일한 원통형 스테인레스 스틸 와이어 (240 μm의 직경) (1, 2, 4, 8, 16, 32, 49, 64, 및 81g)의 만들어진 손으로 알루미늄 튜브를 개최. </li><li> 열 고통 테스트에 대한 설명과 같은 일반적인 실험 조건이 기계적 통증 테스트에 적용됩니다. 과목은 잘 준비하고 훈련해야합니다. 이것은 프로브가 부정적 이냐 주사 피부를하지 않을 과목을 안심 특히 중요합니다. 이것은 주제가 일관성이 데이터를 휴식하고 제공하는 데 도움이 될 것입니다. </li></ol> 2. 기계 통증 임계값 결정 <ol><li> 기계 고통 임계값을 확인하려면 먼저 수직으로 실험적으로 염증 병변의 중심에 피부에 가벼운 프로브의 강철 와이어 끝부분을 적용합니다. </li><li> 휴대용 알루미늄 튜브는 다음을 건드리지 않고 피부쪽으로 저하됩니다. 이 방법은 알루미늄 관 내부에 구리 막대의 전체 무게는 강철 와이어 끝에 달려있다. </li><li> 연구 주제는 다음 탐사선이 &quot;예&quot;또는 말씀의 고통에 시달리고 있는지 여부를 나타냅니다 &quot;아니오.&quot; </li><li> 제목 답변이 &quot;노&quot;다음 중 동일한 프로브 또는 다음 무거운 프로브는 다음 사용됩니다하십시오. 이 알고리즘은 오름차순 자극의 순서라고합니다. 무작위로 다음 탐사선이 무겁게 또는 같은 무게의 여부를 결정합니다. 이것은 알고리즘에 눈을 멀게 주제를 유지합니다. </li><li> &quot;예.&quot;이 시리즈의 마지막 두 프로브의 평균 무게는 첫 번째 편향 지점으로 기록됩니다 주제 답변까지 오름차순 시퀀스에서 프로브를 적용합니다. </li><li> 주제 답변 후 &quot;예&quot;내림차순 자극 시퀀스를 사용하기 시작하고, 이전과 같은 가벼운 프로브 또는 동일한 프로브 중 하나를 사용합니다. 무작위로 다음 탐사선이 라이터 또는 같은 무게의 여부를 결정합니다. 이것은 알고리즘에 눈을 멀게 주제를 유지합니다. </li><li> 주제 답변 &quot;아니오.&quot;이 순서의 마지막 두 프로브의 평균 무게는 두 번째 편향 지점을 구성하기 전까지 내림차순 순서에 프로브를 적용합니다. </li><li> 제목 답변이 &quot;노&quot;오름차순 자극 순서로 다시 전환하면. 일곱 편향 포인트가 기록되기 전까지 오름차순과 내림차순 사이에 순서를 대체. 이러한 7 개의 좌표의 평균은 기계 고통 임계값입니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Angst, M. S., Clark, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comment+on+Koltzenburg+et+al.:+Differential+sensitivity+of+three+experimental+pain+models+in+detecting+the+analgesic+effects+of+transdermal+fentanyl+and+buprenorphine.">Comment on Koltzenburg et al.: Differential sensitivity of three experimental pain models in detecting the analgesic effects of transdermal fentanyl and buprenorphine.</a> Pain. 126, 165-174 (2006).</li><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation,+noxious+stimulation,+and+administration+of+a+COX-inhibitor:+A+microdialysis+study.">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation, and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. , (2008).</li><li>Angst, M. S., Koppert, W., Pahl, I., Clark, J. D., Schmelz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+infusion+of+the+mu-opioid+agonist+remifentanil+in+humans+causes+hyperalgesia+during+withdrawal.">Short-term infusion of the mu-opioid agonist remifentanil in humans causes hyperalgesia during withdrawal.</a> Pain. 106, 49-57 (2003).</li><li>Lotsch, J., Angst, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mu-opioid+agonist+remifentanil+attenuates+hyperalgesia+evoked+by+blunt+and+punctuated+stimuli+with+different+potency:+a+pharmacological+evaluation+of+the+freeze+lesion+in+humans.">The mu-opioid agonist remifentanil attenuates hyperalgesia evoked by blunt and punctuated stimuli with different potency: a pharmacological evaluation of the freeze lesion in humans.</a> Pain. 102, 151-161 (2003).</li></ol>

이 동영상은 인간 자원 봉사자의 염증이 피부의 열 및 기계적 통증 임계값을 평가하기위한 알고리즘을 보여줍니다. 고통의 인식은 주관적이다. 적절한 통증 데이터의 컬렉션은 해당 시험 기관 (예 : 조용하고 위안), 내장 데이터 품질 관리 대책 (시험 재시험의 신뢰성), 표준 연구 프로토콜에 엄격한 준수하고, 혼란함을 주죠 요인의 회피와 학습 참가자의 철저한 교육이 필요 (예 : 스트레스, 불안). 이러한 진통 약물의 관리 등 nociceptive 중재자의 로컬 릴리스로 기계론의 데이터의 수집과 같은 중재와 결합하여 통증 민감도에 대한 신뢰할 수있는 주관적인 데이터는 고통의 메커니즘에 대한 값진 통찰력을 제공하고, 그것을 방지하거나 자제하는 것을 의미합니다.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>TSA-II Neuro Sensory Analyzer</td>
<td>Tool</td>
<td>Medoc Advanced Medical Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puntuated Pressure Probes</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alternatively, commercially available von Frey Hairs can be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

우리가 인간의 피부 조직이 특정 nociceptive 및 염증성 biochemicals의 수집에 대한 피부 microdialysis 기술을 보여준 시각 실험의 저널에 이전 문서에서는. 이 문서에서 우리는 종종 microdialysis 절차를 창출하는 데 사용되는 통증 - 테스트 패러다임을 표시합니다. microdialysis과 고통 테스트를 결합하는 것은 고통을 생성 및 전파에 대한 식별 키 biochemicals 책임있게 행동 및 생화 학적 데이터 간의 중요한 연결을 제공합니다. 인간 연구 참가자 염증 피부에 evoking 고통의 두 가지 모델이 표시됩니다. 첫 번째 모델은 열 자극의 도움과 함께 고통을 끝. 여기에 설명된 열을 evoked 통증은 주로 작은 비 myelinated 주변 nociceptive 신경 섬유 (C - 섬유)에 의해 중재됩니다. 두 번째 모델은 첨부터 끝까지 압력 자극을 통해 고통을 끝. 첨부터 끝까지 압력 evoked 통증은 주로 작은 myelinated 주변 nociceptive 신경 섬유 (A - 델타 섬유)에 의해 중재됩니다. 두 모델은 mechanistically 별개이며, 독립적으로 통증 신호에 관련된 두 가지 주요 말초 신경 섬유 집단에 의해 nociceptive 처리를 확인합니다. 열 고통은 TSA II, 상용 온도 감각 분석기 (메독 고급 의료 장비, 더럼, NC)의 도움을 evoked있다. 자극 구성 및 전달은 특정 소프트웨어의 도움으로 처리됩니다. Thermodes 크기와 모양에 차이가 있지만 원칙적으로 가열하거나 다양한 속도로 시간과 여러 기간 동안 냉각 수있는 금속판으로 구성되어 있습니다. 열 evoked 통증을 평가 알고리즘 매니폴드 있습니다. 여기에 나와있는 실험에서 연구 참여자들은 피부 접촉 thermode가 고통을 보여주고하지 않는 온도에서 시작 미리 정해진 속도로 가열하는 동안 통증이 시작하는 시점에서 표시하도록 요청하고 있습니다. 제목 고통을 겪고 시작되는 thermode 온도는 열 통증 임계값을 구성합니다. 기계 고통은 첨부터 끝까지 탐사선과 evoked있다. 이러한 프로브는 여러 제조 업체 (폰 프라이 머리카락)에서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 본 프라이 머리카락의 정확성은 많은 비판 조사관 사용자 정의가 첨부터 끝까지 압력 프로브를 만들어 사용하고 있습니다. 여기에 표시된 실험에서 서로 다른 가중치 여덟 맞춤 제작 첨부터 프로브는 연속 순서로 적용됩니다, 절차는 지각 편향 점, 즉 감정의 통증이나 반대로 아무 고통도에서 변경 사항을 식별, 위, 아래 알고리즘을했다. 지각 편향을 일으키는 평균 무게는 기계 고통 임계값을 구성합니다.

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Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

인간의 학습 과목의 실험적 염증 피부에 열 및 기계적 통증 임계값을 평가 알고리즘이 표시됩니다. 두 통증 테스트 패러다임이 독립적으로 통증을 전달하는 두 가지 주요 말초 신경 섬유 집단에 의해 nociceptive 처리를 검토, 즉 비 myelinated C 섬유와 작은 A - 델타 섬유를 myelinated.

열과 인간 주제에 염증이 피부에 기계적 통증 임계값 결정

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

determining-heat-mechanical-pain-threshold-inflamed-skin-human

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K 조회수.  Stanford University School of Medicine. 인간의 학습 과목의 실험적 염증 피부에 열 및 기계적 통증 임계값을 평가 알고리즘이 표시됩니다. 두 통증 테스트 패러다임이 독립적으로 통증을 전달하는 두 가지 주요 말초 신경 섬유 집단에 의해 nociceptive 처리를 검토, 즉 비 myelinated C 섬유와 작은 A - 델타 섬유를 myelinated.

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

진단 도구를 개발하기 위해 마이크로 전자 기계 시스템 (MEMS)를 사용

연구

생물학

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Murine 피부 이식

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

랫 중심에 엔지니어링된 조직의 주입

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

실연 피부 Allodynia 만성 골반 통증과 공동으로

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

약하게 산란 주제의 디지털 인라인 홀로그램 현미경 (DIHM)

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징<em&gt; 생체</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Here we present a method to measure organismal fat levels in the third instar (L3) larval stage of Drosophila melanogaster. This method exploits the comparatively low density of fat tissue to differentiate between larvae with altered fat stores. Buoyancy-based analysis is a valuable tool for rapid, reproducible, and economical screening.

지방 수준을 결정하는 부력 기반 방법<em&gt; 초파리</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...