이 연구는 의학 연구위원회에서 핵심 기금에 의해 지원되었다. 우리는 기술 도면을 준비 크레이그 니콜에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 그들의 영상 지원을위한 마태 복음 피어슨와 폴 페리에게 감사의 말씀을 전합니다.

모든 동물의 작업은 영국 홈 오피스 (프로젝트 라이센스 번호 PPL 3천7백85분의 60 및 4천4백24분의 60)에 의해 라이센스하에 제도적 지침에 따라 수행 하였다. 1. 준비 <ol><li> 형광 기자 마우스 라인과 적절한 크레-재조합 효소 발현하는 마우스 라인을 결합하여 개발 피부에 melanoblasts 레이블을 지정합니다. 티르 :: CREA, 티르 :: CREB 8 Wnt1의 :: 크레 (14) 크레 발현 선으로 성공적으로 사용되었습니다 R26YFPR 9 리포터 라인으로. </li><li> 층류 후드에서 배양액을 준비하고; (1 %의 v / V의 페니실린 / 스트렙토 마이신)와 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)을 보완, 10 % V / V 소 태아 혈청과 0.584 GM / L의 L-글루타민. </li><li> 라이브 영상 장치는 70 % 에탄올로 닦고하여 영상 실 자료를 소독 그림 1에 설명되어 있습니다. OV 담가 인서트, 촬상 클립, 그리고 O-링을 살균70 % 에탄올에 ernight. 챔버의 뚜껑으로 6 잘 플레이트에서 멸균 뚜껑을 사용합니다. </li><li> 영상 실의 바닥면은 O-링 (그림 1)에 의해 고정 움직임이 둔한 뚱뚱 막으로 구성되어 있습니다. 35mm의 가스 투과 움직임이 둔한 뚱뚱 요리와 함께 시작합니다. 영상 실에 접시를 놓고 하나의 에지 면도날 가스 투과 막 잘라. 영상 실에 고정 막에 O-링을 밀어 넣습니다. </li><li> 영상 클립 (총 6) 대신에 배아 피부에 사용하기 전에 1 % 아가로 오스로 가득해야합니다 (그림 1) 클램프. C.를 레인지 작동 60 °로 냉각에 의해 멸균 dH보다 2 O와 아가로 오스의 2 % 용액을 제조 10 ㎖의 배지와 혼합 1:1 (2 단계 참조) 60 ℃로 예열 멸균 6 잘 플레이트에 6 영상 클립을 서있다. 좋은 pastette를 사용하여 각 클립의 가운데에 1 % 아가로 오스 솔루션에 떨어져 냉각 할 수 있습니다. 을 방지하기 위해 각 웰에 1 ㎖ 차가운 멸균 PBS를 추가마르지 garose. 영상 클립은 PBS에서 몇 시간 동안 저장 될 수있다. </li><li> 배아 피부의 섬세한 분리를 수행하고 대신 대나무 케밥 꼬치 사용할 수있는 젓가락을 사용하는 카시와기 등. 3에 설명 된대로 해부 조직의 머리 스틱 방식 &#39;을 사용하여 처리 할 수 있습니다. 단일 양날 면도날을 사용하여 꼬치의 평평한 끝의 작은 틈새를 확인하고 강모 부드러운 칫솔을 삽입합니다. 그것의 길이는 약 15 cm입니다 있도록 꼬치 트림. </li><li> 전체 환경 챔버와 공 초점 현미경을 사용하거나 공기에서 5 % CO 2를 제공하는 최고 챔버를 준비. 이전 영상에 적어도 1 시간 동안 37 ° C로 현미경 무대를 Prewarm. 이것은 그들이 워밍업으로 무대 구성 요소의 확장으로 인한 샘플 드리프트를 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 한 빠르고 쉽게 실험적를 설정하는 각 문화의 중간에 중심을 할 수 있도록 현미경의 제어 소프트웨어를 사용하여 다중 위치 세트를 준비t. </li></ol> 2. 절차 <ol><li> 마우스 메이트와 일 E0.5로 첫날 포스트 교미를 지정합니다. 하루 E14.5에서 경추 탈구하여 여성을 추려하고, 작은 정중선 절개 머리와 꼬리쪽으로 피부를 제외한 당기는 후 내부 복막 절단 백 몸체의 양쪽에 pealing 의해 체강을 노출. 집게로 단단히 잡고 수술 가위를 사용 mesometrium 따라 자르는 추위 멸균 PBS로 자궁을 해부하다. 필요한 때까지 얼음에 자궁을 유지합니다. 자세한 설명은 시어 외. (2007 년) 15를 참조하십시오. </li><li> 먼저 미세 집게 두 쌍을 따로 잡아 당겨 탈락을 해제 수술 가위로 자궁 벽의 길이를 절단하고 탈락의 배아를 해부하여 자궁에서 배아를 해부하다. 형광 기자의 표현 (필요한 경우)에 대한 화면입니다. </li><li> 해부하기 전에 잘린 배아를 추려. 잠수정equently 꼬리를 제거하여 단일 에지 면도날을 사용하여 손발 후 앞다리 뒷다리. 필요한 경우 유전자형에 대한 조직을 유지. </li><li> rostro - 꼬리 방향으로 중간 선 부근에 ventrum에 절개를합니다. 단계 1.6에 기재된 헤어 스틱을 사용하여 조심스럽게 동시에 배아 회전 내부 결합 조직으로부터 피부를 멀리 애타게. 피부를 완전하게 제거하는 것이 아니라 첫 번째 절개의 복부 가장자리 멀리 함께 첨부 해 두지 마십시오. </li><li> 그것은 다음 마운트하기가 매우 어렵 기 때문에가 피부를 망쳐하게하지 않는 것이 중요합니다. 이를 방지 건조 페트리 접시의 표면에 헤어 스틱 (피부 측까지)를 이용하여 피부를 평평하고 하나 양날 면도날을 사용하여 얻어 배아 줄기에서 배기판. 피부는 제거되기 전에 피부 측 해부 조직 및 배아의 접합부의주의 관찰에 의해 표피 측으로부터 구별 될 수있다. 해부 조직의 영역입니다약 0.5 mm 2 E14.5 배아를 해부 할 때. </li><li> 아가로 오스는 조직의 피부면을 만지지 않도록 피부의 상단에 영상 클립을 놓습니다. 클립의 측면까지 조직의 가장자리를 애타게 신중하게 다음 60 초 동안 서서 할 수 있습니다. 클립을 거꾸로하고 머리 피부를 평평하게하고 가능한 한 적게 (이미지를 만들 영역에서) 조직의 표면을 만지지주의하면서 공기 방울을 제거하기 위해 스틱 사용합니다. </li><li> 그들은 조이도록 촬상 클립의 양쪽에 두 개의 단순 엄지 매듭을 이용한 영상 클립에 피부를 매고 클립의 상단 부근에 홈에 피부를 당겨 실크 봉합사 실을 사용. 클립을 반전, 이미지 삽입 및 자료의 장소 안에 밀어 넣습니다. (단계 1.2 참조) 배지 ~ 5 ㎖로 삽입을 입력합니다. 그림 1은 영상 실의 어셈블리를 설명합니다. </li><li> 나머지 5 샘플에 대한 프로토콜을 반복합니다. </li></ol> 3. 라이브영상 <ol><li> 이미징 챔버는 표준 6 - 웰 플레이트와 같은 크기를 가지고 있습니다. 공 초점 현미경의 무대에 챔버를 탑재 적절한 플레이트 인서트를 사용합니다. </li><li> 자동화 된 단계는 병렬 문화가 이미지에 필요합니다. 공 초점 소프트웨어 이미지까지 6 위치를 정의합니다. 정확한 설정이 사용 현미경의 능력에 의존 할 것이다. 일반적으로 작은 Z-스택 (3-5 Z-위치가 어느 단계 드리프트를 고려하여) 6 각 위치에서 사용되며, Z-스택은 18 ~ 24 시간 동안 매 2 분을 캡처됩니다. 라이브 - 이미징 애플리케이션에 레이저 전력 및 요구 Z-섹션들의 개수를 감소시키기 위해 광학적으로 최적의 핀홀 설정보다 더 넓게 사용하는 것이 일반적으로 유리하다. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

우리는 거꾸로 공 초점 현미경에하는 라이브 세포 이미징 의무 특수성이다 문화 배아 피부에하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 6 문화가 병렬로 몇 군데 리겔 원래의 방법 (6)의 뉴 클레오 포어 막에 대한 의존도를 제거 할 수 있도록 최근의 개선 사항이 포함되어 있습니다. 유사한 기술에서 중요한 기술적 인 차이는 공기 액체 계면을 확립하고 또한 커버 슬립 역할을 가스 투과성 움직임?...

전통적으로 배아 피부는 마우스 배아에서 해부와 폴리 카보네이트 (polycarbonate) 뉴 클레오 포어 막에 장착하여 배양하고있다. 멤브레인이어서 따라서 현상 3,4 조직의 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지 배지에 부유된다. 이 기술은 조직을 고정하고 마커 7로 β-갈 락토시다 아제를 사용하여 melanoblast 분포를 평가하여 melanoblast 동작을 분석 실험하는 데 사용되었습니다. 우리는 생체 피부의 문화 6 라이브 영상의 형광 표지 melanoblasts 수있는 방법을 개발했습니다. 여기에서 우리는 공 촛점 이미징을 살고, 설정에, 해부에서 세부 방법을 설명하고 최근의 일부 개선을 포함한다. Melanoblasts은 멜라닌 세포의 배아 전구체, 머리와 피부에 색소를 생산하는 세포입니다. Melanoblasts는 개발 마우스 전자에서 배아 일 9 (E9) 주위에 신경 튜브에 인접한 신경 능선에서 발생mbryo. 그 후 그들은 외배엽 및 개발 somites 사이의 dorsolateral 경로를 따라 이동한다. E12.5에서 그들은 증식과 그들의 이동을 계속 표피 진피에서 이동합니다. 기본 모낭 패턴이 모공을 지역화하는 E14.5에서 표피와 E15.5의 melanoblasts에 의해 형성하기 시작합니다. melanoblast / 멜라닌 세포 개발의 검토를 위해 토마스 에릭슨 (2008) 1을 참조하십시오. melanoblast 인구 레이블을하기 위해 우리는 티르를 결합했다 :: 조건부 ROSA26 궤적 9에서 노란색 형광 단백질 (YFP)을 표현 R26YFPR 동물과 마우스 티로시나 아제 프로모터 (8)에 의해 구동 크레-재조합 효소를 표현 CREB 동물. 우리는 거꾸로 공 초점 현미경을 사용하여 문화 배아 피부와 캡처 이미지를하는 방법을 설명합니다. 그것은 모트 등의 설명 원래의 방법. (2010) 6 형태로 구성된다. 본방법은 6 자 형식으로 영상을 허용하고 문화를 지원하는 뉴 클레오 포어 막에와 리겔에 대한 의존도를 제거합니다. 대신 배아 피부를 안정화하는 1 % 아가로 오스의 소 블록을 사용. 마트 리겔에 대한 의존도를 제거하면, 특히 수용성 성장 인자에 대한 배아 피부의 반응이 연구의 초점이 상황에서 중요하다. 우리의 원래 방법은 이미 melanoblast 개발 10-13에 새로운 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다 그리고 우리는 우리가 여기에서 설명하는 개선이 다수의 병렬 문화가 요구 사항, 특히 실험적인 기술로 더 강력 할 것으로 예상.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Melanoblasts은 멜라닌 세포의 전구체를 파생 신경 문장이다; 피부와 머리카락의 색소를 생산에 대한 책임 세포. Melanoblasts는 이후에 개발 머리가 1,2 여포 식민지 배의 표피를 통해 마이그레이션 할 수 있습니다. 신경 능선 세포의 이동은 광범위하게 체외에서 연구되고 있지만, 생체 내 방법을 아직 잘 특히 포유류의 시스템에서 개발되지 않습니다. 하나의 대안은 생체의 Organotypic 문화 3-6을 사용하는 것입니다. 마우스 배아 피부 배양 조직 3,6의 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면 (ALI)의 유지 보수를 필요로한다. 마우스 배아 피부의 고해상도 라이브 영상이 ALI를 유지뿐만 아니라 문화가 반전 짧은 작동 거리 대물 렌즈와 대부분의 공 초점 현미경 따라서 호환 할 수 있습니다뿐만 아니라 좋은 방법의 부족에 의해 방해되었다. 이 문서에서는 메타에 최신의 향상된 기능에 대해 설명합니다OD 즉, 이러한 문제점을 극복하고 생체 외 배양 6 배아 피부의 고해상도 촛점 이미징을 허용하는 가스 투과 막을 사용한다. melanoblast 특정 크레-재조합 효소가 R26YFPR 기자 라인과 함께 마우스 라인을 표현을 사용함으로써 우리는 형광이 피부의 문화 내에서 melanoblast 인구 레이블을 할 수 있습니다. 이 기술은 수 melanoblasts 자신의 행동과 그들이 개발하는 조직과의 상호 작용을 관찰의 라이브 영상. 대표 결과는 사양에 라이브 이미지를 병렬로 6 문화를 보여주기 위해 포함되어 있습니다.

그림 2는 티르에서 배아의 피부를 사용하여 시간 경과 실험에서 대표적인 결과를 보여줍니다 :: CREB는 E14.5에서 R26YFPR 배아를 x. 6 배아 피부의 문화는 18 시간 동안 매 2 분 공 초점 현미경으로 몇 군데 있었다. 프리웨어 이미지 분석 소프트웨어 패키지는 ImageJ에 6 영화 YFP - 표지 melanoblasts의 행동을 분석하는데 사용 하였다. melanoblasts 자동 (제스퍼 Søndergaard이 페더슨?...

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Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

ex-vivo-culture-mouse-embryonic-skin-live-imaging-melanoblast

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

12.5K 조회수.  University of Edinburgh.  우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다. 

비디오: Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

기본 인간 난관 상피 세포의 전의 VIVO 문화

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

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The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

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