Name: gap junctional intercellular communication: a functional biomarker to assess adverse effects of toxicants and toxins, and health benefits of natural products
Uploaded: 2016-12-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

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이 연구의 프로토콜은 쥐가 인도적과 고통의 경감을위한 관련하여 처리 한 것을 보장하기 위해 동물 관리 및 생체은 실험이 수행 된 곳이다 일본의 건강 과학, 국립 연구소의 이용위원회에 의해 승인되었다. 1. SL-DT 생물 검정 <ol><li> 이글스 함유 시드 3 × 105 WB-F344 쥐 간 상피 세포 (35) 상 mm 직경의 배양 플레이트를 37 ºC 100 % 상대 습도 (RH), 5 % 인큐베이터 배지 플러스 5 % 소 태아 혈청, 및 배양 세포를 변형 CO 2. </li><li> 배양 세포들은 100 % 합류 (일반적으로 2 일)에 도달하고 후술하는 바와 같이 셀의 원하는 치료 실험을 수행 할 때까지. <ol><li> 복용량 응답 실험을 실시 <ol><li> 10 ㎕의 100 % 아세토 니트릴 4 μL 6 μL에서 페난 트렌의 2 mM의 스톡 용액 20 μL 및 phenan의 20 mM 스톡 용액 8 μl를 추가원액을 각각 첨가 볼륨 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 트렌. </li><li> 4 μL 6 μL 8 μL, 10 μL, 상기 차량 제어 역할을하는 아세토 니트릴 용액을 각각 첨가 볼륨 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 아세토 니트릴 100 % 용액 20 μL를 추가한다. </li><li> 37 ° C, 100 % RH 5 % CO 2로 설정 인큐베이터에서 15 분 동안 접시를 품어. </li><li> 1.3 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 행동 시간 응답 실험 <ol><li> 각 시점 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 분)에 대한 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 페난 트렌의 20 mM 스톡 용액을 7 μL를 추가한다. </li><li> 각 시점은 차량 제어 역할을하는 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 7 μL를 추가한다. </li><li> 각 지정된 시간 페이지에 대 한 번호판을 품어37 ° C에서 항온 OINT, 100 % RH, 5 % CO 2. </li><li> 1.3 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 시간 복구 실험을 실시 <ol><li> 15 분 동안 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 페난 트렌의 20 mM 스톡 용액을 7 μL를 추가한다. </li><li> 차량 제어 역할을 15 분 동안 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 7 μL를 추가한다. </li><li> 페난 트렌 또는 아세토 니트릴 중 하나를 함유하는 배지를 경사 분리하고 인산염 완충 식염수 3 ㎖ (PBS)로 3 배 각 린스. </li><li> 원하는 복구 시간 (즉, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 분) 37 ℃의 배양기에서 100 각 플레이트에 신선한 성장 배지 2 ㎖를 첨가하고 부화 % RH 및 5 % CO 2. </li><li> 1.3 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 행동의 메커니즘 실험 <ol><li> 신호 전달 억제제의 추가 예 </em&gt; 15 분 동안 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 D609의 20 mM 스톡 용액 5 μL. </li><li> 차량 제어 역할을 15 분 동안 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴의 5 μL를 추가한다. </li><li> 추가로 15 분 동안 성장 배지 플러스 D609 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 페난 트렌의 20 mM 스톡 용액을 7 μL를 추가한다. </li><li> 차량 제어 역할을 추가로 15 분 동안 성장 배지 플러스 100 % 아세토 니트릴 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 7 μL를 추가한다. </li><li> 1.3 단계로 진행합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 어느 부드럽게 매체를 주입하여 진공 흡인에 의해 배양 배지를 버리고. 참고 : 적절하게 유해 폐기물을 포함하는 배지를 폐기 할 것. </li><li> 3 PBS ㎖의 betwee 캔트 또는 흡인 중 하나와 세포에게 3 회 씻어여기서 n은 린스. </li><li> 피펫 1 mg을 ml의 / 루시퍼 노란색 염료는 각 셀 플레이트에 PBS (LY)에 용해 ㎖로. </li><li> 부드럽게 판의 세 가지 영역에서 세포 집단을 둥근 모서리와 # 20 외과 스틸 칼날 압연하여 세포에 염료를 미리로드. <ol><li> 메스 수직 (90 ° 각도) 배양 접시의 가장자리에서 5mm를 배치하는 것으로 시작하고 15 ° (도 1 참조)의 각도에 대해 수직이 각도에서 메스 롤. 참고 :이 집게 손가락과 엄지 손가락 사이의 메스를 곤란에 의해 달성된다. (둥근 블레이드는 단순히 세포를 통해 롤백) 메스 부드럽게 15 ° 위치로 90 °에서 갈 수 있도록 중력을 사용합니다. 이 운동은 시각적으로 눈에 띄는 들여 쓰기 라인을 떠날 것이다. </li></ol></li><li> 실온에서 3 분 동안 LY 용액으로 세포를 인큐베이션. </li><li> 경사 분리 또는 LY 대기음 모든 extrace을 제거하기 3 ㎖ PBS로 3 회 씻어llular 세포 외 배경 형광을 제거하기 위해 염색. </li><li> 세포를 해결하기 위해 10 % 인산염 완충 포르말린 용액의 0.5 ML을 추가합니다. 참고 : 포르말린에 고정 후, 공기는 ​​세포 건조하고 LY 염료의 최소 광표백으로 최대 2 년 동안 어둠 속에서 저장합니다. 필요한 경우, 형광 색소의 전면을 시각화하고, 10 % 포르말린 용액으로 재수. </li><li> 200X의 배율 536분의 428 나노 미터의 여기 / 방출 피크 이색 큐브를 구비 한 표면 형광 현미경을 이용하여 세포를 고정보기. 들여 쓰기 라인이 비전의 수평 필드에 평행이되도록 모든 판을 맞 춥니 다. 참고 : FITC의 이색 큐브가 잘 작동합니다. <ol><li> CCD 카메라 및 지원 소프트웨어로 이미지를 캡처합니다. <ol><li> CCD 카메라에 대한 지원 소프트웨어를 열고 자동 노출 설정을 사용합니다. 디지털 이미지를 획득하기 위해 &quot;캡처&quot;버튼을 사용합니다. &quot;저장&quot;버튼을 사용하여 .tif 파일로 이미지를 저장합니다. </li></oL&gt; </li></ol></li></ol> 간 조직에 SL-DT 분석 2. 적응 <ol><li> 5 주 이전, 남성 피셔 344 쥐 사용하여 해부 가위에서 약 간의 왼쪽 엽에서 2 × 2cm 슬라이스를 제거하고 접시에 젖은 거즈 (12)으로 덮여 중량 측정을 플라스틱에 놓습니다. </li><li> 피펫 0.5 내지 1 ㎎을 함유하는 PBS 용액 ㎖ / ml의 루시퍼 옐로우 및 로다 덱스 트란 (RD) 플라스틱의 간 조각의 표면에 무게 플레이트의 각. 주 : RD는 간극 결합 채널을 통과 할 수없고로드 된 셀을 표시하는 염료이다. </li><li> 날카로운 블레이드와 무게 판의 염료 용액을 가지고 간 조각의 표면에 약 1cm 길이 3 ~ 5 절개를 확인하고 절개를 채우기에 충분 추가 염료를 추가합니다. </li><li> 접시의 무게를 플라스틱에 실온에서 3 분 동안 조직을 인큐베이션. </li><li> PBS 5 ㎖로 3 회 헹군다. </li><li> 조직 비켜 수정실온에서 어두운 곳에서 50 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 10 % 인산염 완충 포르말린 30 ㎖에 rnight. </li><li> 다음 날, 물 조각을 씻어 1 × 1 × 0.5 cm 3 스트립에 가위를 해부와 절개 주위 조직을 손질 한 후 파라핀 13 조각을 포함하는 표준 기술을 사용합니다. </li><li> 제 전까지 어둠이 5㎛의 두께로 절개 라인에 수직 인 슬라이스 저장 샘플을 마이크로톰 절편 13 표준 기술을 이용하여 묘화한다. </li><li> 섹션 1.10 7 항에 형광 염료 전선의 이미지를 시각화하고 캡처하는 CCD 디지털 카메라가 장착 된 표면 형광 현미경을 사용합니다. </li></ol> 3. 정량화 GJIC <ol><li> (예 ImageJ에)은 형태 학적 소프트웨어 패키지를 사용하여 형광 염료 확산을 측정한다. <ol><li> &quot;파일&quot;탭을 클릭 한 다음 클릭을 열고 &quot;열기&quot;저장된 이미지. </li><li> 염료 전면의 윤곽을 추적하기 위해 도구 모음 탭에서 &quot;무료 손 도구&quot;를 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;분석&quot;탭을 클릭 한 다음 &quot;측정&quot;을 클릭합니다. 참고 :이 원하는 경우 다른 스프레드 시트 프로그램으로 복사 할 수 있습니다 스프레드 시트의 영역 값을 생성합니다. </li></ol></li><li> 스프레드 시트 프로그램을 사용하여, 염료가하기 식을 사용하여 제어 플레이트의 이동 영역에 의한 실험 접시 염료 확산 영역을 분할하여 제어 (FOC)의 비율을 계산한다 : <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54281/54281equation1.jpg" /> E = 그러한 특정 투여 량 및 시간에서 화학 물질로 처리 된 세포와 같은 실험 변수에 노출 된 세포에서의 염료 확산 영역 관심있는 화학 물질을 용해하는 데 사용되는 비히클로 처리 된 세포는 상기 제어의 염료 확산의 C = 영역 주의 : 차량의 영향을 결정하기 위해,E는 비히클 처리 된 세포에 염료 확산 영역 것 및 C는 차량에 의해 처리되지 세포 염료 확산 영역 일 것이다. 차량의 효과는 바람직하게는 10 % 미만이어야한다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

SL-DT 분석은 GJIC을 측정하는 간단하고 다양한 기술이지만, 적절한 실험 프로토콜을 설계 할 때 고려되어야한다 몇 가지 중요한 문제들이있다. SL-DT 분석을 사용하여 GJIC의 강력한 측정을 위해 셀 갭 접합을 통해 LY의 좋은 염료 확산이 있어야합니다. 최소한, 적절한 시간 염료 양방향 메스로드 셀에서 셀의 8 개 이상의 행을 퍼지는 것을 보장하도록 선택되어야한다. 또한, 염료 메스로드 셀에서 이전...

이 방법의 전체 목표는 화합물의 잠재적 인 독성을 평가하기 위해, 간단하고 비교적 저렴 ​​광범위한 기술을 제공하는 것이다. 이것은 여러 세포주에서 사용할 수있는 시험 관내 접근법이다. 표면 형광 현미경을 갖춘 표준 세포 생물학 연구소는이 분석을 사용하여 연구를 수행 할 수 있습니다. 세포 기능의 우리의 기본 지식은 시험 관내 생물 검정에 크게 의존하고 있으며, 제약, 환경 오염 물질, 식품 태어난 오염 물질의 독성 평가에 필수적인 요소가되고있다. 불행히도, 모든 독성 종합적 평가에 대한 요구를 충족시킬 수있는 단일 관내 생물학적 검정 시스템이 없다. 시험 관내 분석의 많은 설계 및 평가뿐만 아니라 특정의 생화학 적 또는 분자 포인트를 평가하도록 최적화되어있다. 이들은 매우 자주의 섭동을 반영하도록 설정 높은 처리량 결합에스트로겐 수용체 1 신호와 같은 특정 신호 전달 경로. 이 전략은 매우 성공적 이었지만, 유전자의 발현에 관여하는 신호 전달 경로의 수는 광범위한 매우 복잡 평가하는 특정 신호 전달 경로를 선택하는 작업을한다. 높은 처리율 프로토콜은 현재 개발되고 동시에 단일 분석의 한계 중 일부를 극복하기위한 하나의 접근법을왔다 수많은 신호 전달 경로를 측정하기 위해 사용되고있다. 그러나 모든 신호 전달 경로가 성공적으로보다 포괄적 인 접근 방식에 통합되었습니다 더불어 새로운 신호 전달 경로는 지속적으로 더 복잡하게하는이 평가 과정을 발견되고있다. 특히 높은 관통 넣어 시스템, 생체 외 접근법의 광범위한 번호를 사용하여, 포괄적 인 독성 평가도 매우 고가이며 대부분의 한 조사에 도움이되지 않습니다에 대한 연구 프로젝트를 주도했다. GJIC는 프로세스이다 TIGhtly 멤브레인 및 세포 골격 단백질과 2,3- 주요 세포 내 신호 전달 경로와 상호 작용에 의해 조정 된 전압의 변화에, 칼슘 농도의 pH, 산화 환원의 균형에 의해 제어. 따라서 GJIC의 억제는 다양한 세포 유형의 스트레스, 다른 세포의 기능 장애 또는 다른 신호 전달 경로의 섭동을 반영 할 수있다. 제한된 신호 전달 생물 검정의 이용을 극복하는 또 다른 방법은, 가장 많이있는 경우, 신호 전달 경로는 상기 간극 결합 채널 4-8 통해 협력 세포 내 신호 전달 체계에 의해 다양한 변조되는 생물학적 현상을 활용하는 것이다. 세포 내 신호 전달 체계는 다수의 다중 경로 제어하에 있더라도, 갭 정션 채널을 통해 세포 간 신호 전달은 궁극적으로 부분적으로 또는 완전히 닫힌 개폐되는 채널의 함수이다. 이것은 쉽게 다양한 사용하여 측정 할 수있는 포인트를 제공한다체외 생물 검정 시스템 7인치 조직의 항상성 세트 포인트는 갭 접합부 간 통신에 대한 화합물의 효과를 결정하는 단계, 개방 채널을 필요로 고려 (GJIC)의 화합물 4,8- 잠재적 독성을 결정하는보다 포괄적 인 접근이다. 본질적으로, 유전자 발현을 제어하는 ​​복수의 신호 전달 사건을 조정에서 중심 역할이 중요한 생물학적 현상 독성 효과의 광범위한 평가를 허용한다. 따라서, 생물 검정 GJIC 평가는 화합물의 독성 잠재 성을 평가하는 좋은 출발점이다. GJIC을 평가하는 데 가장 광범위한 기술이 형광 프로브로 세포를 미리로드 한 후, 인접 셀에로드 된 세포 또는 세포로부터 염색제의 이행을 감시에 기초한다. 염료를 미리로드하는 기술은 프로브 (11)의로드 (10), 및 메틸 에스테르를 긁어, 미세 주입 구를 포함했다 </suP&gt;. 메스로드 - 형광 염료 전송 (SL-DT) 방법은 스크랩 부하의 변형입니다 - 엘 Fouly (10)에 의해 개발 된 전송 분석을 염색. 오히려 더 침습적 스크랩보다,이 보고서의 메스를로드하는 방법은 침략 피해를 최소화 세포 (그림 1)의 단층을 통해 라운드 블레이드와 메스의 부드러운 롤을 포함한다. 이 기술의 장점은 셀보다는 마이크로 인젝션 분석의 단일 세포 집단의 독성 평가한다. 마이크로 인젝션 기술 및 형광 프로브의 메틸 에스테르를 사용하는 기술을 사용하는 방법은 훨씬 많은 시간을 소비하며 상당히 높은 기술 수준을 요구하는 반면 또,이 분석의 단순성 단시간에 다수의 판의 빠른 검출을 허용한다. GJIC 연구의 모든 필요를 충족하는 단일 방법이 없지만; SL-DT 분석은 할 수있는 단순하고 매우 저렴하고 다양한 분석입니다다양한 화합물의 독성의 초기 평가에 대한 요구의 대부분을 충족. 주요 장점은 다음과 같습니다 : 단순, (FRAP) 분석 및 분자 형광 프로브 분석, 대형의 GJIC의 신속하고 동시 평가 지역의 활성화를 photobleaching에 후 같은 미세 주입, 형광 복구와 같은 다른 방법에 필요한 장비 나 기술에 대한 특별한 필요 생체 내 연구를위한 자동화 된 형광 현미경 영상 분석뿐만 아니라 적응성 높은 처리량 설정에 도움이되는 세포의 수.

<table><tbody><tr><td>WB-F344 rat liver epithelial cells</td><td>From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC)</td><td>none</td><td>Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC</td></tr><tr><td>35 mm Culture Plates</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>D-medium, an Eagles modified medium&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&amp;nbsp;</td><td>Formula No. 78-5470EF</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>ThermoFisher/GIBCO&amp;nbsp;</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin-EDTA&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&amp;nbsp;</td><td>15050</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>homemade</td><td>see below for ingredient cat#&#039;s</td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&amp;nbsp;</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&amp;nbsp;</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&amp;nbsp;</td><td>3819--01</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&amp;nbsp;</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, lithium salt</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>rhodamine-dextran</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>1-methylanthracene</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>phenanthrene</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>P11409</td><td></td></tr><tr><td>resveratrol</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>R5010</td><td></td></tr><tr><td>D609</td><td>Tocris Bioscience&amp;nbsp;</td><td>1437</td><td></td></tr><tr><td>acetonitril</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td></td></tr><tr><td>37% solution formaldehyde</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&amp;nbsp;</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>#20 surgical blade</td><td>Fine Science Tools Inc.&amp;nbsp;</td><td>10317-14</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical sterile tubes</td><td>Thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Nikon epifluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>Nikon FITC dichroic cube</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>96107</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon Cool Snap EZ CCD</td><td></td></tr><tr><td>imaging system</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system.</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

gap junctional intercellular communication: a functional biomarker to assess adverse effects of toxicants and toxins, and health benefits of natural products

이 프로토콜은 조직의 항상성을 유지하는 중요한 세포 간 과정 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 (SL-DT) 기술에 대해 설명합니다. 등 독성 물질, 독소, 약물에 의한 갭 접합부 간 통신 (GJIC)의 중단은 많은 부작용 건강에 미치는 영향에 연결되어 있습니다. 많은 유전자 기반 인간 질병 갭 정션 유전자의 돌연변이에 관련되어있다. SL-DT 방식은 셀의 커다란 집단에서 GJIC의 동시 평가를위한 간단한 분석 기능이다. 분석 간략 세포 집단을 메스 블레이드 세포막을 교란하여 형광 염료와 프리로드 셀을 포함한다. 형광 염료는 그 후 지정된 시간에 대해 인접 셀에 간극 결합 채널을 통해 통과시킨다. 분석 후, 세포에 포르말린을 첨가하여 종료한다. FLUO의 확산세포의 인구를 통해 rescent 염료는 표면 형광 현미경으로 평가되고 이미지가 공개 도메인에서 발견 무료 소프트웨어 패키지를 포함하여 사용할 수있는 형태 계측 학적 소프트웨어 패키지의 수와 분석된다. 이 분석은 또한 처리 된 동물의 다양한 기관에서 조직 조각을 사용하여 생체 내 연구에 적용되고있다. 전반적으로, SL-DT 분석은 시험 관내 약리학 및 독성 요구의 넓은 범위를 제공 할 수 있으며, 잠재적으로 더 짧은 시간에 더 많은 샘플을 명료하게 자동 형광 현미경 영상 분석 높은 처리량 설정 시스템에 적용될 수있다.

GJIC의 중단 광범위하게 불리한 건강에 미치는 영향 (14)을 유도하는 유전자 조절의 nongenotoxic, 후생 유전 학적 수준에서 독성 화합물을 식별하기위한 바이오 마커로 사용되어왔다. 예를 들어, 다환 방향족 탄화수소 (PAHs의)는 환경의 유비쿼터스 오염 물질은하지만 그들의 분자 구조 (15)의 함수로서 자신의 후생 유전 학적 독성에 따라 다릅니다. 저 분자량의 ...

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Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

이 프로토콜은 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 기술에 대해 설명합니다. 갭 접합부 간 통신은 조직의 항상성을 유지하고이 세포 신호의 중단은 건강에 악영향을 갖고있는 중요한 세포 과정이다.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

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14.9K 조회수.  Michigan State University.  이 프로토콜은 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 기술에 대해 설명합니다. 갭 접합부 간 통신은 조직의 항상성을 유지하고이 세포 신호의 중단은 건강에 악영향을 갖고있는 중요한 세포 과정이다. 

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

연구

발생학

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

생체공학

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

This in-vivo human bioassay can be used to study human volunteers and patients. Samples are collected from pertinent tissue sites such as the skin via aseptically inserted microdialysis catheters (Dermal Dialysis, Erlangen, Germany). Illustrated in this example is the collection of interstitial fluid from experimentally inflamed skin in human volunteers. Sample collection can be combined with other experimental tests. For example, the simultaneous assessment of locally released biochemicals and subjective sensitivity to painful stimuli in experimentally inflamed skin provides the critical biochemical-behavioral link to identify biomarkers of pain and inflammation. Presented assay in the living human organism allows for mechanistic insight into tissue-specific processes underlying pain and/or inflammation. The method is also well suited to examine the effectiveness of existing or novel interventions - such as new drug candidates - targeting the treatment of painful and/or inflammatory conditions.
This article will provide a detailed description on the use of microdialysis techniques for collecting interstitial fluid from experimentally inflamed skin lesion of human study subjects. Interstitial fluid samples are typically processed with aid of multiplex bead array immunoassays allowing assaying up to 100 analytes in samples as small in volume as 50 microliters.


A technique is presented for the in-vivo collection of interstitial fluid samples from pertinent tissue sites (here, experimentally inflamed skin) for the measurement of biochemicals mediating pain and inflammation.

Nociceptive 및 염증성 중재자의 조직 특정 측정을위한 인간 - VIVO의 Bioassay

This in-vivo human bioassay can be used to study human volunteers and patients. Samples are collected from pertinent tissue sites such as the skin via ...

생물학

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic effects of drugs and downstream pathways involved would help gain insight into the molecular mechanisms of neuroprotection/neurotoxicity and could potentially facilitate drug development. However, many existing in vitro toxicity assays have major limitations &#8211; most assess neurotoxicity and neuroprotection at a single time point, not allowing to observe the time-course and kinetics of the effect. Furthermore, the opportunity to collect information about downstream signaling pathways involved in neuroprotection in real-time would be of great importance. In the current protocol we describe the use of a real-time impedance-based cell analyzer to determine neuroprotective effects of serotonin 2A (5-HT2A) receptor agonists in a neuronal cell line under label-free and real-time conditions using impedance measurements. Furthermore, we demonstrate that inhibitors of second messenger pathways can be used to delineate downstream molecules involved in the neuroprotective effect. We also describe the utility of this technique to determine whether an effect on cell proliferation contributes to an observed neuroprotective effect. The system utilizes special microelectronic plates referred to as E-Plates which contain alternating gold microelectrode arrays on the bottom surface of the wells, serving as cell sensors. The impedance readout is modified by the number of adherent cells, cell viability, morphology, and adhesion. A dimensionless parameter called Cell Index is derived from the electrical impedance measurements and is used to represent the cell status. Overall, the real-time impedance-based cell analyzer allows for real-time, label-free assessment of neuroprotection and neurotoxicity, and the evaluation of second messenger pathways involvement, contributing to more detailed and high-throughput assessment of potential neuroprotective compounds in vitro, for selecting therapeutic candidates.

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

신경과학

전기 셀 기판 감지에 의한 MOF 유도 셀 거동 변화 평가

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of MOFs in biomedical and industrial applications has led to concerns regarding their safety. Herein, the profile of a selected MOF, a zeolitic imidazole framework, was evaluated upon exposure to human lung epithelial cells. The platform for evaluation was a real-time technique (i.e., electric cell-substrate impedance sensing [ECIS]). This study identifies and discusses some of the deleterious effects of the selected MOF on the exposed cells. Furthermore, this study demonstrates the benefits of using the real-time method versus other biochemical assays for comprehensive cell evaluations. The study concludes that observed changes in cell behavior could hint at possible toxicity induced upon exposure&#160;to MOFs of different physicochemical characteristics and the dosage of those frameworks being used. By understanding changes in cell behavior, one foresees the ability to improve safe-by-design strategies of MOFs to be used for biomedical applications by specifically tailoring their physicochemical characteristics.

저자 스포트라이트: Advances in Evaluating Human Lung Epithelial Cells' Response to Metal-Organic Frameworks (금속-유기 프레임워크에 대한 인간 폐 상피 세포의 반응 평가의 발전) 

The following study evaluates the toxicological profile of a selected metal-organic framework utilizing electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), a real-time, high-throughput screening technique.

금속-유기 프레임워크 독성 프로파일의 실시간 평가를 위한 전기 전지-기질 감지

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

갭 접합부 시험에 대한 기능 분석; 인듐 - 주석 산화물에 자기편 세포의 전기 천공 법 (electroporation)

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

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화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서 속도론 해석

Nociceptive 및 염증성 중재자의 조직 특정 측정을위한 인간 - VIVO의 Bioassay

신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

금속-유기 프레임워크 독성 프로파일의 실시간 평가를 위한 전기 전지-기질 감지

금속-유기 프레임워크 독성 프로파일의 실시간 평가를 위한 전기 전지-기질 감지

금속-유기 프레임워크 독성 프로파일의 실시간 평가를 위한 전기 전지-기질 감지

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

갭 접합부 시험에 대한 기능 분석; 인듐 - 주석 산화물에 자기편 세포의 전기 천공 법 (electroporation)