저자는 fluc/mrfp/sr39tk의 리포터 유전자의 선물 Sanjiv Gambhir 감사드립니다. 이 작품은 캐나다의 줄기 세포 네트워크 (SCN), 그리고 제시의 여행 재단의 지원을받는되었다.

1. C2C12 Myoblasts의 유지 관리 및 전파 <ol><li> 판 C2C12 75cm 2 플라스크에 myoblasts와 10 %의 최종 농도에 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 높은 포도당 Dulbecco의 수정 된 이글의 세럼 (HG-DMEM)에 세포를 유지하고 있습니다. 이 myoblastic 인구를 고갈되므로 세포는 언제든지 합류가하는 것을 허용하지 않습니다. ° C 사용하기 전에 물을 욕조에 37 항상 따뜻한 매체 :. 매체는 매일 참고 변경해야합니다. </li><li> myoblasts이 약 80 % 합류가되면 새로운 플라스크에 통과 세포. 문화 매체를 대기음. 트립신 억제 혈청을 포함 문화 매체의 모든 흔적을 제거하는 4-5 ML 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)으로 세포를 씻으십시오. 간단히 2-3 ML 0.25 % 술병에서 자기편 myoblasts을 해리하는 (w / V) 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션과 세포 레이어를 씻어. 5 분에 37 ° C에서 보육의 트립신과 장소 플라스크를 대기음. </li><li> 이 incuba 동안기는 HG-DMEM/10 % FBS 매체의 구 ML로 새 플라스크를 준비합니다. trypsinization 후, 중간에있는 모든 세포의 수집을 보장하기 위해 셀 및 피펫 4-5 시간에 완벽한 매체 10 ML를 추가합니다. 새로운 플라스크에 세포 현탁액 1 ML을 추가하고 37 5 % CO 2에 품다 ° C. </li></ol> 2. C2C12 세포 Transfection <ol><li> 일단 세포는 Invitrogen에서 제조업체의 지침에 따라, confluency 50 %를 transfect에 도달했습니다. 간단히, 4.5 ML OPTI-가상 매체와 90 μl Lipofectamine 2000 시약 조화를 이루고 있습니다. 또 다른 관에서 4.5 ML OPTI-가상으로 36 μg CMV-trifusion 기자 유전자 DNA가 조화를 이루고 있습니다. 5 분을 결합하고 기다리는 각 관을 긋기. 두 튜브의 내용을 결합하여, 부드럽게 혼합 정확히 삼십분 동안 실온에서 배양 참고 :. 두 번째 플라스크는 단지 부정적인 제어 역할을 Lipofectamine 및 OPTI-가상을받을 수 untransfected 셀에 설정해야합니다. </li><li> C2C12 세포에서 미디어를 제거하고 15.5을 추가신선한 HG-DMEM/10 % FBS 매체의 ML. 20 ML에 총 볼륨을 가져 transfection 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 세포가 37 최소한 20 시간을 위해 밤새 transfect 할 수 있도록 허용 ° C. </li><li> 다음 날, transfection 매체를 대기음 10 ML HG-DMEM/10 % FBS를 추가합니다. </li><li> 역 형광 현미경으로 세포를 볼 수 있습니다. 시야과 붉은 형광 이미지를 모두 캡처 (TRITC 필터 큐브를 이용하여, mrfp 예 / EM : 607분의 584 nm의). transfection 효율을 생성하는 뷰의 여러 분야에 대한 시야에서 볼 셀의 총 횟수로 나눈 형광에서 볼 RFP - 표현 세포의 수를 계산합니다. </li></ol> 3. 셀 Survivability / MTT 분석의 평가 <ol><li> 24 잘 플레이트의 각도에 transfection, 판 1x10 5 C2C12 세포하기 전에 어느 날. 셀은 HG-DMEM/10 % FBS 500 μl 권 도금해야합니다. </li><li> 다음 날, transfect의 myoblasts 하룻밤 이전에 설명 된대로. transfection 시약에 대한 제조업체의 제안에 따라24 잘 접시 t 권. 컨트롤에 불과 Lipofectamine (NO DNA)와 우물 세트를 품다. 그 적절한 transfection가 발생했습니다 보장하기 위해 형광에 따라 세포를 볼 수 있습니다. </li><li> HG-DMEM/10 % FBS 5 MG / ML thiazolyl 블루 tetrazolium 브로마이드 (MTT)에 transfection 매체 및 품다 myoblasts을 제거합니다. transfected 우물의 8 D-luciferin을 추가, 4 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 우물에서 매체를 제거합니다. 각도에 이소프로판올 180 μl를 추가하여 파란색 formazan의 결정을 Solubilize. 15 분에 37 ° C에서 흔들어. </li><li> 96 - 웰 플레이트에있는 침전물, 피펫 솔루션을 피하고 575 nm의에서 흡광도를 참조하십시오. </li></ol> 4. 이식을위한 Myoblasts의 작성 <ol><li> , 미디어를 제거 HBSS와 myoblasts을 씻고, 및 1.1에 명시된 바와 같이 셀을 trypsinize. </li><li> 전체 매체 중 4 ML의 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> hemocytometer 사용 10 6 myoblasts를 포함하는 볼륨을 생성하기 위해 셀을 계산합니다. 피펫 권멸균 1.5 ML의 microtubes에 매화. ~ 10 %의 transfection 효율이 값은 100,000 루시 페라 제 - 표현 세포가 이식 후 GE ExploreOptix 스캐너에서 감지되고있는 것으로 나타났습니다. </li><li> 10 6 C2C12 세포를 포함, 15 μl의 최종 주입 볼륨을 충족해야합니다. 필요한 경우, 1 분에 2,000 rpm으로 microtubes을 원심 분리기. 피펫으로 표면에 뜨는을 자세히 대기음. HG-DMEM는 FBS를 부족의 15 μl로 세포를 다시 일시 중지합니다. </li></ol> 5. 세포 주입 <ol><li> 2퍼센트 2 / isoflurane % O 2 마우스를 마취. 등쪽의 뒷다리 영역에서 머리카락을 따. 1.5 % 2 / isoflurane % O 2 마취를 유지합니다. </li><li> 확인 C2C12 myoblasts도 일시 중지됩니다. 쉬운 위치에 마우스로, 뒷다리 다리를 확장하고 직접 30 ° 각도에서 gastrocnemius 근육의 외측 머리에 세포를 주입하는 인슐린 주사기를 사용합니다. 오른쪽 뒷다리와 untransfected myoblasts의 정수로 transfected myoblasts를 삽입contralateral (왼쪽) 뒷다리 다리를 O. </li><li> 기준 bioluminescence 검사를 수행 빠르게 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓고, 광학 스캐너에 무대에 마우스를 전송할 수 있습니다. 마취 줄을 연결. 마우스가 anesthetized 상태로 유지하려면, 두 사람이 마취 라인을 연결하기 위해 존재해야합니다 스캐너의 다른 장소 동물 동안. </li><li> 분사의 영역이 표시되도록 부드럽게 뒷다리 다리를 확장합니다. 예를 들어, 의료 테이프와 같은 부드러운 접착제와 장소에 테이프를 두 다리. </li><li> 챔버를 닫고이 감지 배경 신호를 증가로 더 빛이, 스캐너의 내부에 액세스 할 수 없습니다 있는지 확인합니다. 스캐너는 bioluminescence 이미징에 대한 제조업체의 지침에 포함 된 매개 변수를 설정해야합니다. 특히, &quot;더 이상 레이저&quot;를 선택하지 않습니다 보장합니다. </li><li> 뽑혀 지역 및 시작 검사 주변 관심 (ROI)의 영역을 그립니다. </li></ol> 6. MDX 마우스로 Fluc 기판, D-luciferin의 주입 &lt;좋았어요&gt; <li> 마우스가 anesthetized intraperitoneally는 반딧불 루시 페라 제 기판, D-luciferin의 150 밀리그램 / kg를 주입하는 동안 (40 MG / ML 주식 솔루션에서, 제조업체의 지침에 따라 구성). </li><li> 마우스를 복구하고 다음 스캔을 위해 마우스를 준비하기 전에 15 분 정도 호응 기간을 허용합니다. </li></ol> 7. BLI는 DMD의 마우스 모델에 임플란트 후 루크 - 표현 MPCs를 타겟팅 할 수 <ol><li> 5.1에서 설명 된대로 이해 기간 후, 다시 마우스를 마취. </li><li> 광학 스캐너에 다시 마우스를 전송하고 백그라운드 검색과 같은 방식으로 다른 bioluminescence 검색을 수행합니다. </li><li> 20 분 통풍 관 기간이 최대 신호 강도를 제공해야하지만, 이후의 스캔이 수행 될 수 있습니다. </li><li> 이미지 수집이 완료되면, 당신의 기관 동물 윤리위원회 및 동물 관리 (CCAC)의 캐나다 협의회가 설정 한 지침에 따라 마우스를 희생. 내가 바로 뒷다리의 근육과 장소를 분리N 포르말린 10 % 파라핀 근입을 수정합니다. myoblasts의 근육 주사를 확인하는 루시 페라 제에 대한 immunohistochemistry 착색을 수행합니다. </li></ol>

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본 연구에서는, 우리는 이식 후 비 invasively 대상 myoblasts / MPCs에 신속하고 신뢰할 수있는 분자 영상, 리포터 유전자의 접근 방식을 설명하고 있습니다. 이 연구는 bioluminescense 이미징 (BLI), 사실은, 쉽게 세포의 주입을 통해 세포 engraftment의 길이 방향 평가에 적용 할 수있는 세포를 타겟으로하는 방식을 통해 이식 MPCs의 단기 현지화을 보여줍니다 동안 안정적으로 명시 리포터 유전자. ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> C2C12 myoblasts </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 된 이글의 매체 </td><td> 생명 기술 </td><td> 12800-017 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 생명 기술 </td><td> 12483020 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 생명 기술 </td><td> 25200-72 </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 균형 소금 솔루션 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> H6648 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> 생명 기술 </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> 니콘 이클립스 TE2000-5 </td><td> 니콘 인스트루먼트 주식회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenolight D-luciferin </td><td> PerkinElmer </td><td> 122796 </td><td> PBS 40 MG / ML </td></tr></tbody></table>

molecular imaging to target transplanted muscle progenitor cells

Duchenne 근육질 영양 장애 (DMD)는 3500 소년의 1에 영향을 미치는 심각한 유전 신경 근육 장애이며, 진보적 인 근육 퇴행 1, 2에 의해 특징입니다. 환자에서 손상된 myofibers를 다시 생성 할 수 주민 근육 위성 세포의 능력 (SCS)는 4 점점 비효율적이된다. 따라서, 건강 분야에서 근육 전구 세포 (MPCs) / myoblasts의 이식은 DMD에 유망한 치료 방법이다. 줄기 세포 치료의 사용에 대한 주요 제한은, 그러나, 이식 세포의 장기 모니터링을위한, 그 효과를 평가하기위한 신뢰할 수있는 이미징 기술의 부족이다. 여기, 우리는 myoblast 이식의 성공 여부를 평가하는 비 침습적, 실시간 접근 방식을 설명합니다. 이 방법은 (반딧불 루시 페라 [fluc], monomeric 붉은 색 형광 단백질 [mrfp]와 sr39 thymidine의 키나제 [sr39tk]) expre 유전자로 구성된 통합 된 퓨전 리포터 유전자 활용ssion은 여러 이미징 modalities 9, 10으로 이미징 할 수 있습니다. 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 단일 광자 방출 계산 된 단층 촬영 (SPECT), 자기 공명 영상 (MRI), 광학 이미징, 높은 주파수 3D-초음파 등의 영상 modalities의 다양한 고유의 장점과 한계를 각각, 지금 사용할 수 있습니다 11. Bioluminescence 이미징 (BLI) 연구 예를 들어, 상대적으로 낮은 비용과 높은 처리량가되는 장점이 있습니다. 그것은이 연구에서, 우리는 마우스에 주입 후 가능한 C2C12 myoblasts의 단기 현지화를위한 융합 유전자 및 bioluminescence 이미징 (BLI) 내에 포함 된 반딧불 루시 페라 제 (fluc) 리포터 유전자 시퀀스를 이용, 이런 이유로 DMD의 모델 12-14 (X 염색체 [MDX] 마우스에 근육 영양 장애). 중요한 것은, BLI라는 MPCs 후 주입의 동력학을 검토 할 수있는 수단으로 우리를 제공하며, t를 통해 반복적으로 세포를 추적 할 도움이 될 것입니다IME와 다음과 같은 마이그레이션. 우리 리포터 유전자 접근 방식이 더 우리는 하나의 생활 주제에 여러 이미징 modalities를 병합 할 수 있습니다, 단층 자연, 훌륭한 공간 해상도와 큰 동물과 인간 10,11까지 확장 할 수있는 능력에 따라, PET 미래 작업의 기초를 형성 할 우리 제안은 잠복기 모델 및 임상 응용 프로그램에 세포 개발 방법의 급속한 번역을 촉진 할 수 있습니다.

50~60% confluency시, C2C12 myoblasts는 transiently 위에서 언급 한 퓨전 기자 유전자가 반딧불 루시 페라로 구성된 구조와 transfected되었습니다 [fluc], monomeric 붉은 색 형광 단백질 [mrfp]와 sr39 thymidine 키나제 [sr39tk] (그림 1A). Transfection 효율은 건설 기자의 mrfp 시퀀스의 활용, 형광 현미경 (인물 1B, C)을 통해 계산되었다. 셀 survivability은 BLI 기판, D-luciferin <strong...

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Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

myoblast 이식의 성공 여부를 평가하는 비 침습적 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 그의 표현 다른 이미징 modalities를 이미징 할 수 있습니다 유전자로 구성된 통합 된 퓨전 리포터 유전자의 장점을 걸립니다. 여기, 우리는 사용을<em&gt; fluc</embioluminescence 이미징을 통해 세포를 타겟팅 할 수&gt; 리포터 유전자 시퀀스.

이식 근육 전구 세포를 타겟팅 할 수 분자 이미징

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

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9.1K 조회수.  Lawson Health Research Institute. myoblast 이식의 성공 여부를 평가하는 비 침습적 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 그의 표현 다른 이미징 modalities를 이미징 할 수 있습니다 유전자로 구성된 통합 된 퓨전 리포터 유전자의 장점을 걸립니다. 여기, 우리는 사용을 fluc 리포터 유전자 시퀀스.