이 작품은 SK와 히스 부여 R01EB008722 국립 연구소에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원의 연구 활동에 의해 지원되었다.

A. 재료 준비 및 살균 <ol><li> 사전 준비 캡슐화 재료에 혼합하고 37 ° C. 며칠에 대한 잠복기에 의해, (PBS) 호수 버퍼 인산의 photoinitiator Irgacure 2959 (I2959)의 0.5 % WT의 솔루션을 준비 이 솔루션은 다음 주사기 살균에 대한 필터링 및 장기 사용을 위해 상온에서 저장할 수 있습니다. </li><li> 합성 수 젤의 원하는 구성에 따라, 폴리머 및 crosslinker의 무게가 필요 (예 : Microsoft Excel과 같은 스프레드 시트 프로그램을 사용하여) 계산합니다. 폴리머 주어진 무게가 hydrogels, crosslinker 및 전체 젤 볼륨의 폴리머 솔루션 부분에서 원하는 농도를 달성하기위한 정의된 총 볼륨에서 용해해야하기 때문에 또한 스프레드 시트를 사용하여 결정되어야합니다. 모든 펜던트 moieties (예, 접착제 RGD 또는 oligopeptide를 포함 YGSR) 이전 crosslinking에 통합하는 경우에는 비슷한 계산을하여야한다. </li><li> Eppendorf 튜브에 필요한 폴리머와 crosslinker의 금액과 장소의 무게를. 얻은 고분자의 실제 중량에 대해 적절하게 계산 스프레드 시트를 조정합니다. (참고 : 볼륨 얻은 폴리머와 crosslinker의 실제 대량 보상을 변경할 수 있습니다.) </li><li> 개별적으로 포장 무균 1 ML 일회용 주사기의 정상을 차단하기 위해 면도날을 사용하여 겔 금형을 준비합니다. 확인 평면 절단은 photopatterned의 젤을 위해 사용되는 금형에 대해 이루어집니다. </li><li> 주사기 금형, Eppendorf 튜브 (뚜껑 열고) 및 살균 광원 (일반적으로 생물 안전 캐비닛에 내장) 아래에 다른 필요한 자료를 놓고 30 분 소독. </li></ol> B. 셀 준비 <ol><li> 살균에 따라 적절한 멸균 버퍼 볼륨을 추가합니다 (스프레드 시트 계산 당, 버퍼의 선택은 달라질 수 PBS와 같은 triethanolamine 같은 약한베이스 버퍼는 일반적으로 자유 라디칼과 마이클 타입 crosslinking, 각각을 위해 사용되는 수있는 동안) 폴리머 Eppendorf 및 (옵션) 펜던트 잔기 포함하는 (예를 들어, 접착제 펩타이드)와 디졸브로 와동 (멸균 후드 랩 외부 parafilm으로 Eppendorf을 vortexing 경우). </li><li> 폴리머 솔루션에 펜던트 잔기 솔루션의 적절한 볼륨을 추가하고 parafilm과 인감을 바꿈. 셀 준비 중에 ° C가 반응 37 간략 와동과 부화 (가능한 경우, 로타리 저어 접시 위에). 펩타이드가 최종 히드로겔의 펜던트 그룹으로 포함되도록 이것은 아크릴 레이트 또는 메타 크릴 레이트에 대한 펩타이드에 thiol의 반응 (시스테인 그룹을 통해)이 포함됩니다. </li><li> Trypsinize 및 세포 및 젤류의 각 집합에 해당하는 숫자를 포함하는 부분에 별도의 계산. 예를 들어, 10000000 세포 / 개인 원뿔 관에 ML, 별도 1500000 세포의 밀도가 세 50 μL 젤의 집합에 대한. 그것은 더 이상 4보다 젤가 겔화의 타이밍 (젤 여러 세트를 합성하는 경우, 모든 집합에 대한 폴리머 솔루션의 적절한 볼륨을 포함하는 단일 Eppendorf 준비를 사용할 수 있습니다)으로 인해 개별 세트로 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 세포를 원심 분리기. </li><li> 세포가 다운 방적 있지만 <ol class="lalpha"><li> 라이트는 자유 라디칼 crosslinking를 시작 : 전체 젤 세트 볼륨의 10 % (0.05 WT %의 최종 개시제 농도)로 동등한 폴리머 솔루션에 0.5 WT % I2959 솔루션을 추가합니다. </li><li> 마이클 타입 (덧셈) crosslinking : 적절한 농도 솔루션을 달성하기 crosslinker에 버퍼를 추가합니다. </li><li> 연속 crosslinking 들면 :이 젤은 crosslinking 두 종류를 통합하고 이전 단계를 모두 필요로합니다. </li></ol></li></ol> C.의 히드로겔 형성 <ol><li> centrifuged 셀 부분에서 뜨는을 대기음. 세포 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많은 매체를 제거하는 초기 열망하고 다시 대기음 후 정착에 액체 기다립니다. </li><li> 세포가 균일하게 분포돼 때까지 폴리머 솔루션 세포 펠렛을 Resuspend. 천천히 솔루션을 pipetting하여 기포 형성을 최소화하고 아래로 (약 10 사이클 세포를 배포하기에 충분해야합니다.) </li><li> Crosslinking의 Hydrogels <ol><li> 나누어지는 주사기 팁 금형에 적절한 볼륨 : 라이트는 자유 라디칼 crosslinking을 시작. 근본 crosslinking에 대한 자외선에 주사기를 노출 (예 : 365 NM에 10 분 노출, 4 mW/cm2 UV 라이트는 아크릴 레이트 기능화 폴리머에 대한 일반적입니다.) 이 단계는 세포 자외선 노출 전에 정착 최소화하기 위해 신속하게 수행하여야한다. </li><li> 마이클 타입 (덧셈) crosslinking : 다양한 오리피스 피펫 팁을 사용하면, 고분자 / 세포 솔루션 crosslinker 솔루션의 적절한 볼륨을 추가 원하는 개별 겔 볼륨에 피펫을 설정, 솔루션을 피펫 아래로균질 및 주사기 팁 금형으로 나누어지는. 이 단계는 세포의 균등을 보장하기 위해 신속하게 수행하여야한다. crosslinking에 대한 문화 모자 10~30분이 (개별 시스템에 따라) 인큐베이션 수 있습니다. </li><li> 연속 crosslinking : 이것은 다음 마이클 타입 이외의 첫번째 반응은 두 번째 crosslinking에 대한 조명에 노출을 포함한다. 이론 crosslinks의 일부 분일 뿐인 걸까은 첫 번째 crosslinking 동안 반응해야하고 살균 마스크 전에 소독 핀셋을 사용하여 빛을 노출로 겔 표면에 직접 적용해야합니다. 그것이 젤 크게 가교 지역에서 우선적으로 통합할 수 있기 때문에 기능화 염색 (20 NM의 겔에서 최종 농도에서 예, methacrylated rhodamine (MeRho)가)도 (그림 2, patterning을 시각화하는 초기 솔루션에 추가할 수 있습니다 ). </li></ol></li></ol> D. 셀 문화 및 분석 <ol><li> 다음 crosslinking, 부화 및 분석을위한 매체를 포함하는 조직 문화 판의 우물 (다음 단계 참조)에 플런지 젤. </li><li> 형광 죽은 / 라이브 얼룩 키트를 (그림 3, 4)를 사용하고 생존 능력, 세포는 형태로 가벼운 현미경 (일반적으로, 합성 hydrogels은 투명 그림 3)를 사용하는 시각 수 있습니다. (예, 4&#39; - 6 - Diamidino - 2 - phenylindole (DAPI)) 세포 굴지 (예 : rhodamine 또는 플루오레신가 phalloidin로 표시)과 핵에 대한 얼룩 것은 다음과 같은 절차를 표준으로 고정하고 permeabilization 절차를 (그림 4)를 사용하여 수행할 수 있습니다. <ol class="laplha"><li> PBS로 5 분 배 구조를 씻어. </li><li> 실온에서 30 분 1 ML 4 % 포름 알데히드에 부화하여 젤을 수정. </li><li> 3퍼센트 (W / V) BSA와 0.5 % (W / V) PBS에서 트윈을 포함 차단 솔루션 배 구조를 씻어. </li><li> 0.25 % (W / V) 20 분 솔루션을 차단에서 트리톤 X와 함께 막을 Permeabilize. </li><li> 솔루션을 차단과 배 구조를 씻어. </li><li> 0.66 μg / 상온에서 두 시간 동안 솔루션을 차단에 ML FITC 또는 rhodamine phalloidin과 함께 F - 굴지에 대한 얼룩. </li><li> 솔루션을 차단과 배 린스. </li><li> 20 분 0.4 μL / PBS에 ML DAPI를 사용하여 세포 핵을 얼룩. </li><li> PBS로 3 배 린스. </li><li> epifluorescent 또는 공촛점 현미경을 사용하여 세포를 시각화. </li></ol></li><li> 젤 내의 세포의 확산은 일반적으로 시판 assays (예, 전체 DNA 또는 생화학 콘텐츠)를 사용하여 평가됩니다. PicoGreen 더블 - 좌초된 DNA quantifying에 대한 얼룩 일반적으로 사용하고 민감한 형광 핵산이다 (싱어 외 있습니다.). 세포도 계산하고 2 단계에 설명되어있는 시각화 방법을 사용하여 초기 제어 번호 정상화 수 있습니다. </li><li> Histological sectioning와 얼룩은 또한 세포를 시각화하고 매트릭스를 형성하는 데 사용할 수 있습니다. 3D hydrogels의 탈수 및 sectioning에 대한 다음과 같은 프로토콜은 유리 슬라이드에 횡단면 조각을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다 : <ol class="lalpha"><li> 고정 및 탈수 <ol class="lroman"><li> PBS로 3 배 표본 린스. </li><li> 4 % paraformaldehyde 30 분 - 5 수정. </li><li> PBS로 3 배 표본 린스. </li><li> 25 EtOH에서 샘플을 품어 ° C 다음 EtOH (V / V) 물 농도 (순서대로) 각각 1 시간 동안 : 50 % 70 % 95 %, 95 %, 100 % (이 시점에서, 표본 25 밤새 저장할 수 있습니다 ° C). </li></ol></li><li> 클리어링와 침투 <ol class="lroman"><li> 25 1 시간 ° C, 65 한 시간 뒤에 ° C. 100 % Citrisolv로 전송 </li><li> 샘플의 단면이 노출되는 등 페트리 접시에 면도날로 절반 샘플 컷. </li><li> 65 1 시간에 대한 Citrisolv / 마이크로 컷 파라핀의 혼합물로 전송 1시 1분 ° C. </li><li> 65 1 시간 100 % 마이크로 컷 파라핀으로 전송 ° C. </li><li> 65 밤새 백퍼센트 마이크로 컷 파라핀으로 전송 ° C. </li><li> 65 1-2시간 100 % 마이크로 컷 파라핀으로 전송 ° C. </li></ol></li><li> 퍼가기 <ol class="lroman"><li> 100 % 파라핀과 껍질 - 거리 금형의 위치 표본. </li><li> 금형 침대에서 왁스의 작은 금액을 놓고, 단면이 아래로 향하게있는 샘플의 두 반쪽을 삽입합니다. </li><li> 상단 필터 조각을 적용 <ol><li> 잠수함 상단 부분을 추가 왁스를 추가하고 ~ 10 분 동안 경화 수 있습니다. </li></ol></li><li> ° C의 냉장고가 강화하기 위해 표본은 하룻밤 수 있도록 4 삽입을 전송. </li><li> 스피스먼 섹션 수 있습니다에드 다음날은 일반적으로 슬라이스 당 50-10 μm의 두께에 상용 microtomes를 사용합니다. 일반적으로 껍질 - 거리 금형은 마이크로톰 단계에 대해 수직으로 장착되며, 수동 제어는 칼날과 샘플의 섹션 두께, 슬라 이서 및 정렬을 설정하는 데 사용됩니다. </li></ol></li><li> RNA 추출 유전자 발현도 (예, 실시간 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 통해) 양적 평가 수 있습니다. 3 차원 hydrogels에서 RNA 추출, 아래는 그 중 예를 들면,에 대한 프로토콜은 훨씬 간단 2D 사건에서 상당히 다릅니다. <ol class="lroman"><li> 각 3D 히드로겔에 대한 인증 RNAse 무료 Eppendorf 튜브에 레이블을 각 튜브 500 μL Trizol ® 시약을 추가합니다. </li><li> 명확한 솔루션 얻을 때까지 수동으로 hydrogels을 부러 유봉 (조직 분쇄기)를 사용합니다. 확인 다른 그라인더는 각 조건에 사용됩니다. </li><li> 와동 각 Eppendorf 20 초 동안 샘플을 균질 수 있습니다. </li><li> 핵 단백질의 단지의 완전한 분리를 허용하기 위해 5 분 동안 실온에서 샘플을 품어. </li><li> 20 분 얼음 쿨 샘플 </li><li> 각각의 샘플 및 와동 200 μL (사람마다 ML Trizol) 클로로포름을 추가합니다. </li><li> 다섯 분 실온에서 샘플을 품어. </li><li> 4 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 ° C를 15 분. </li><li> 새로운 Eppendorf 튜브 (계면 지역 및 로우어 레드, 페놀 - 클로로포름 단계를 피하는)에 수성 단계 (명확 상단 레이어)를 전송합니다. RNA는 명확 수성 단계에 남아 있습니다. </li><li> RNA 격리 및 저장을위한 일반적인 기법을 이제 사용할 수 있습니다. </li><li> 다음 RNA 추출, 리버스 transcriptase 실시간 PCR을위한 상용 키트는 종종 일부 수정 (Elisseff 외., Strehin 외.)으로 사용됩니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 대표 결과 : photopatterned hydrogels 및 젤류 내에서 세포의 캡슐의 시각화의 대표적인 결과를 그림 2-4 (로 위의 프로토콜에서 참조)를 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 3D 캡슐 절차의 개요. 다이어그램 단계 stepwise 프로토콜 섹션 제목과 일치합니다. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="그림 2" /> 연속 마이클 형 외에 다음 급진 중합을 사용하여 그림 2. Photopatterned의 히드로겔. 사진 반응의 색소의 설립과 함께 부분적으로 가교 히드로겔의 photopatterning의 (A) 도식. (B) 서클 또는 (C) 스트 라이프 투명 필름 마스크 hyaluronic 산성 hydrogels를 패턴. Methacrylated rhodamine (MeRho)는 오직 조명에 노출되었던 젤의 지역에서 통합됩니다. 스케일 바 = 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 차원 hydrogels에서 세포의 시각화. 줄기 세포는 (a) 가벼운 현미경을 통해 시각 또는 (b) 라이브 (녹색, Calcein AM)와 죽은 (빨강, Ethidium homodimer - 1) 얼룩 24 시간 조명을 통해 가교 hyaluronic 산성 히드로겔에서 1,000,000 세포 / ML에서 캡슐을 따라 자유 라디칼 메커니즘을 시작하였습니다. 스케일 바 = 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 차원 hydrogels에서 세포의 시각화. hMSCs는 (마이클 타입 메커니즘을 통해 가교 hyaluronic 산성 히드로겔에서 1,000,000 세포 / ML에서 캡슐 다음 (A) 라이브 셀 (Calcein AM) 또는 (b) 세포 굴지 (rhodamine phalloidin)과 핵 (DAPI) 5 일간 스테인드 ) 펜던트 접착제의 펩티드 및 bifunctional proteolytically 분해 펩티드 crosslinkers를 사용합니다. 스케일 바 = 100 μm의.

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li><li>Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Responsive+Synthetic+Hydrogels.">Cell-Responsive Synthetic Hydrogels.</a> Adv Mater. 15, 888-892 (2003).</li><li>Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Photoencapsulation+in+Hydrogels.">Cellular Photoencapsulation in Hydrogels.</a> Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).</li><li>Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+auricular+chondrocyte+expansion+on+neocartilage+formation+in+photocrosslinked+hyaluronic+acid+networks.">Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks.</a> Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).</li><li>Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microenvironments+for+controlled+stem+cell+differentiation.">Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Mode+Thiol-Acrylate+Photopolymerization+for+the+Synthesis+of+PEG-Peptide+Hydrogels.">Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels.</a> Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-responsive+hydrogel+for+encapsulation+of+vascular+cells.">Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells.</a> Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).</li><li>Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ECM+Production+by+Cells+Encapsulated+in+Hydrogels.">Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels.</a> Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).</li><li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels.">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li></ol>

설명 프로토콜 cytocompatible 방식으로 히드로겔 공사장 공중 발판 내에서 세포를 캡슐로 간단하고 강력한 방법을 나타냅니다. 말기 차별화된 이후 이러한 기술은 특히 중요하고 줄기 세포는 2D 3D microenvironments에 비해 현저하게 다른 동작을 수 있습니다. 도 자료의 주입 (예에서 현장 급진 중합), 세포 캡슐화 및 생존과 차별에 대한 분석을 포함하는 치료 방법에 대한 소재 개발 과정에서 도움이 될 수 있습니다. 설명 순차 프로세스 공간 히드로겔 환경을 조작하는 데 사용하고, 따라서 세포의 행동 (Khetan 외를 참조하십시오.)하실 수 있습니다. 전체 설명 프로토콜의 가장 중요한 요소는 사용되는 모든 솔루션의 균질성입니다. 특히, 특별한주의가 crosslinker 솔루션뿐만 아니라 다음 피펫 resuspension에 의해 세포가 균일하게 예비 중합체 솔루션에 배포하고 있으며, 해결이 잘 혼합되도록로 이동해야합니다. 이것을 보장하기 위해 실패하면 셀 또는 겔 구조와 붓기 지역 유사 clumping 발생할 수 있습니다. 프로토콜 여기 캡슐 세포에 대한 절차에 주로 초점을 제시하지만, 그것은 캡슐 일반적으로 2D 시딩용으로 작성된 분석 프로토콜을 일부 조정이 필요한 수도주의하는 것이 중요합니다. 몇 가지 예제가 hydrogels에 세포를 시각화 및 평가를위한 그림했다.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.2 M Triethanolamine Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0449</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>1x, sterile liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead staining kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine Phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>R415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D9542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Citrisolv</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-143975</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-cut paraffin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>24202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizol reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.22 &mu;m pore size nylon syringe filters</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>09-719C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 mL disposable syringes</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>Cut syringes at consistent height for UV exposure</td>
</tr>
<tr>
<td>Wide orifice pipette tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>254 nm germicidal UV light source</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Built into most biological safety cabinets</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cellular encapsulation in 3d hydrogels for tissue engineering 

hydrogels 내에서 세포의 3D 캡슐은 culturing 세포 및 조직 공학을위한 구조의 개발을 향해 점점 더 중요하고 인기있는 기술을 나타냅니다. 이 환경은 더 인해 조직과 같은 속성과 3D 환경, 표준 조직 문화에 비해 세포가 생체내에서 관찰 무엇 모방한 것이었 지요. 합성 고분자 hydrogels은 안정이나 새로운 조직이 캡슐 세포에 의해 입금 그대로 가수 분해 또는 proteolysis를 통해 저하될 수 있도록 설계 수있는 물을 부었 네트워크입니다. 고분자의 다양한는 같은 폴리 (에틸렌 글리콜)과 hyaluronic 산성 이러한 응용 프로그램에 대해 살펴왔다. 가장 일반적으로, 고분자는 이러한 methacrylates 또는 다양한 메커니즘을 통해 crosslinking를 겪고 수 acrylates 같은 반응 그룹으로 작용합니다. 캡슐 줄기 세포 (. 버딕 외)의 분화를 포함하여 생존과 직접적인 세포 표현형을 개선하기 위해 - 생화 학적 신호의 물리적 또는 펜던트 공유 결합 정관을 통해, 예를 들어 - 지난 10 년간 많은 진전이 엔지니어링이 microenvironments을 이루어왔다. 세포의 3D 캡슐에 대한 다음과 같은 방법 cytocompatibility을 극대화하고 히드로겔 처리 단계의 수를 최소화하기 위해 다른 실험실에서 최적화되었습니다. 다음과 같은 프로토콜 (절차의 그림에 대한 그림 1 참조), 그것은 crosslinking를 겪고 수 기능화 고분자가 손에 이미 것으로 간주됩니다, 같은 조직 공학 분야에 적용 고분자 화학 우수 리뷰는 다른 찾을 수 있습니다 (버딕 외.) 이러한 방법은 폴리머 타입의 범위와 호환됩니다. 또한, 마이클 타입 추가 (Lutolf 외를 참조하십시오.)와 자유 라디칼 (Elisseeff 외를 참조하십시오.) 메커니즘 여기에 초점을 맞춘 가벼운 시작은 보고된 crosslinking 기술의 단지 작은 부분을 구성합니다. 반응 그룹의 일부가 처음 추가 crosslinking에 의해 소비하고 근본적인 메커니즘 뒤에있는 혼합 모드 crosslinking은 캡슐화된 세포 (Khetan 외., 살리 나스 외.)의 표현형를 지시하고 또 다른 일반적으로 사용하고 강력한 패러다임이다.

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Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

cellular-encapsulation-in-3d-hydrogels-for-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

36.7K 조회수.  University of Pennsylvania. 우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

비디오: Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Experimental Approaches to Tissue Engineering

조직 공학 실험 접근법

연구

생물학

Title Cell Encapsulation by Droplets

흩뿌려진의 제목 셀 캡슐화

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these models utilize reconstituted basement membrane derived from animals which contain a variable amount of growth factors and cytokines that can influence the growth of these cell culture models. Here, we describe in detail the preparation and use of PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel that is devoid of animal-derived material and pathogens to encapsulate and propagate the ovarian cancer cell line, OVCAR-5. We begin by describing how to prepare the PuraMatrix prior to use. Next, we demonstrate how to properly mix the PuraMatrix and cell suspension to encapsulate the cells in the hydrogel. Upon the addition of cell culture media or injection into a physiological environment, the peptide component of PuraMatrix rapidly self assembles into a 3D hydrogel that exhibits a nanometer scale fibrous structure with an average pore size of 5-200 nm1. In addition, we demonstrate how to propagate cultures grown in encapsulated PuraMatrix. When encapsulated in PuraMatrix, OVCAR-5 cells assemble into three dimensional acinar structures that more closely resemble the morphology of micrometastatic nodules observed in the clinic than monolayer in vitro models. Using confocal microscopy we illustrate the appearance of representative OVCAR-5 cells encapsulated in PuraMatrix on day 1, 3, 5, and 7 post plating. The use of PuraMatrix to culture cancer cells should improve our understanding of the disease and allow us to assess treatment response in more clinically predictive model systems.

This video demonstrates how to encapsulate and culture cancer cells in PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel.

암세포의 PuraMatrix의 캡슐화

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

의 양적 비교 CIS</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

DNA-가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 제조

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...