우리는 수잔 농부와 제브라 피쉬의 치료에 대한 UAB의 제브라 피쉬 연구 시설의 직원을 감사드립니다. 약리학 및 독물학의 부에서 창업 자금에 의해 제공되는 자금.

참고 :이 프로토콜은 버밍엄 기관 동물 관리 및 사용위원회에 위치한 앨라배마 대학에 의해 승인되었습니다. 1. Zebrafish의 사육 및 계란 컬렉션 <ol><li> 사흘 화학 물질 노출을 시작하기 전에, 별도의 남성과 여성에 대한 분할을 사육 탱크를 조립합니다. 양식 시스템 물을 각 탱크의 중간을 입력합니다. 칸막이로 구분하여 각각의 탱크에 2 명의 남성과 3 명의 여성을 배치, 사육 탱크에 c262/c262 물고기 : 그물을 사용하여,의 Tg (GFP 5xERE)을 전송합니다. 각각의 탱크에 뚜껑을 배치하고 날짜와 교차하는 긴장과 레이블. </li><li> 다음날 아침, 모든 장벽을 제거하고 기울기는 사육 수조의 한쪽 끝에서 얕은 지역을 만들기 위해 배플. 제브라 피쉬의 정확한 발달 준비를하기 위해 10 분 간격으로 배아를 수집, 짝짓기를 할 수 있습니다. 배양 접시에 E3B 매체 부드럽게 세척 배아를 사용하여 차 여과기를 세척하여 청소 계란. 영구적으로 성인 물고기를 반환탱크. </li><li> 해부 현미경을 사용하여, 정렬, 계산, 및, 미 수정의 이상 또는 손상 배아를 제거합니다. 어두운주기 : 14시 10분 빛으로 28.5 ° C에서 E3B 매체와 집에있는 페트리 접시에있는 장소의 배아. 배아 밀도 발달에 영향을 미칠 수있다. 60 X 15mm 접시에 100 × 35mm 접시에 더 이상 100 이상의 배아를 더 이상 50 이상의 배아를 놓습니다. </li><li> 24 HPF으로, 200 μM 1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 (PTU)를 포함 E3B와 미디어를 교체합니다. PTU는 색소 형성을 방지하고, 제브라 피쉬 배아 및 향상된 이미지 선명도에 대한 투명한 애벌레를 유지합니다. 주의 : 집중 PTU 주식은 위험합니다; E3B + PTU 솔루션을 할 때 장갑을 착용하십시오. </li><li> 일일 포스트 수정에 (DPF), 수동으로 미세 집게를 사용하여 각 배아에서 융모막을 제거합니다. 융모막은 에스트로겐의 침투에 영향을 나타나지 않습니다, 그러나 제거는 이미지 선명도를 향상시킵니다. 미디어 chorions를 제거 할 필요는 없다. 참고 : 수동 dechorionation에 대한 대안으로, 배아의 일괄 체 할 수 있습니다이전 11 설명한대로 mically, 1 ㎎ / ㎖ 프로 나제 치료를 사용하여 dechorionated. </li></ol> 태아의 2. 화학 처리 <ol><li> 치료 전날, 1,000 배의 DMSO의 농도 (또는 적당한 용매)에 각 화학 물질의 재고 솔루션을 준비합니다. 예를 들면, 10 μM의 비스페놀 A (BPA)으로 배아를 노출 100 % DMSO에 10mM의 BPA의 스톡 용액을 제조 하였다. 이는 각 처리에 균일 DMSO 농도를 보장하고 DMSO의 무독성 1:1,000 희석 차량 제어의 역할을 할 수있다. -20 ° C에서 매장 재고 솔루션 이 프로토콜의 경우, 태아는 1 μM과 10 μM BPA, 18.5 ㎚, 1.85 μM의 genistein, 367 nm의 에스트라 디올 (양성 대조군)와 자동차 (0.1 % DMSO, 음성 대조군)에 노출 될 것입니다. 주의 : 같은 BPA 및 에스트라 디올과 같은 화학 약품이 위험하고 인간의 태아에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 주의 호르몬을 처리하고 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다.</li><li> 치료의 날, 해동 재고 화학 솔루션을 준비했다. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 1 ㎖ E3B + PTU를 피펫 및 주식 화학 용액 1 μl를 추가하여 1:1,000 희석. 소용돌이 적극적으로. 차량 제어로 E3B + PTU에 DMSO 1:1,000 희석. 처리되지 않은 대조군으로 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 1 ㎖의 E3B + PTU를 사용합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 큰 구멍 플라스틱 전송 피펫, 페트리 접시에서 전송 배아를 사용하여 당 3 배아 아니라, 조건 당 3 우물. 장기간의 치료 기간 동안 증발을 방지하기 위해 판의 바깥 쪽 행과 열 (행 A와 E, 열 1, 12)에서 배아를 생략합니다. 외부 우물 E3B + PTU 300 μL로 채워질 수있다. 적절 플레이트 뚜껑을 레이블. </li><li> 뾰족한 플라스틱 전송 피펫으로 각 우물에서 용지를 제거합니다. 배아를 건조 방지하기 위해 신속하게 작업 할 수 있습니다. </li><li> 잘 대응에 처리 액 200 μl를 추가합니다. unde 뚜껑을 놓습니다적절한 우물에 치료의 추가를 확인하기 위해 가이드로 판을 rneath. 와동 각 튜브 용액에 화학 물질을 분배하기 위해 피펫 팅에 앞서. 시각 각 배아 처리 액에 확인. 배아 웰의 측면에있는 경우, 처리 용액에 잘들을 세척하는 클린 전송 피펫을 사용한다. </li><li> 28.5 ℃에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다 태아는 72 HPF에서 형광 분석됩니다. </li></ol> 96 - 웰 플레이트에있는 태아의 3. 자동 영상 <ol><li> 각 웰에 4 ㎎ / ㎖ tricaine의 10 μl를 추가하여 태아를 마취. 참고 : 이전 영상에 태아를 마취. 24-96 HPF에서 제브라 피쉬는 자발적 움직임과 이미지를 캡처하는 동안 변화하는 광원에 깜짝 놀라는 반응을 나타냅니다. 배아를 마취하는 것은 이미징 동안 운동을 감소시킨다. </li><li> 자동화 된 단계에서 96 - 웰 플레이트를 놓고 무대를 보정합니다. 혈구 선 블루 현미경 자동 2011 소프트웨어를 사용하여과 제어, 샘플 캐리어 옵션을 선택하고 멀티 웰 (96)을 선택합니다. 보정을 선택합니다. 무대를 보정하는 단계별 지시 사항을 따르십시오. 참고 :이 단계 이후에 타일 버튼의 선택을 취소하지 마십시오. 타일​​ 버튼을 선택하지 않으면 보정 설정이 손실 될 수 있으며, 96 - 웰 플레이트는 재 교정해야합니다. </li><li> 설정 (BF) 및 10X 대물 시야를 사용하여, 양성 대조군 배아를 식별하고 형광 신호는 카메라가 포화되지 않는 것을 확인하고, BF와 GFP 채널 적절 노출 설정을 설정한다. 하나의 배아에 초점을 총 3 Z-섹션, 위의 하나의 이미지 50 μm의 현재 초점면 아래 한 50 ㎛를 취득하는 현미경을 프로그램. 참고 : 다른 조직이 서로 다른 초점면을 차지하기 때문에 각 제브라 피쉬의 이미지가 초점이 심장과 간으로 캡처를 위해,이 사항을 확인합니다. </li><li> GFP 및 BF의 channe를 사용하여 타일 이미지를 얻기 위해 소프트웨어 매개 변수를 설정LS. 인수 탭에서 고급 설정을 선택합니다. 선택 타일 영역은 다음 타일. 원도 옵션을 선택합니다. 참고 : 바둑판 식 배열이 아니라 각각의 합성 이미지를 만드는 데 사용됩니다. 단일 시야 각 웰의 작은 부분만을 캡처한다. 타일​​링 기능은 자동으로 전체도의 복합 이미지를 만드는 필드 -보기 각 우물에서 여러 인접를 캡처 할 수 있습니다. 각 합성 이미지가 하나의 잘에서 수십 개의 개별 이미지가 포함 된 위치를 자동으로 접시 당 96 합성 이미지를 캡처하는 것이 가능하다. </li><li> 캐리어를 선택하고 인자에게 90 %를 입력합니다. 90 %의 충진율을 선택하면 이러한 각 웰의 면적의 90 %가 합성 화상에 표시 될 것으로 선택된 웰의 여러 이미지를 캡처 할 것이다. NOTE : 충진율을 선정 할 때, 다이어그램이 묘화되는 영역을 나타내는 표시 될 것이다. 우물의 영역을 포함하는 비율을 선택이 실험에 적합합니다. </li><li> 옵션에서 원하는 중첩의 양을 선택합니다. 참고 : 하나의 대표 이미지를 함께 타일을 바느질 할 때, 10 %의 중첩 이미지 사이에 부드러운 솔기 수 있습니다. 스티치 화상이 불필요한 경우에는, 0 % 오버랩을 사용하여 촬상 시간을 줄이는 것이다. 90 % 곡선 인자 및 5 % 오버랩을 사용하여, 단일 웰의 합성 화상 (59)에 개별 이미지로 구성된다. </li><li> 영상을 시작합니다. 현미경은 자동으로 이미지를 수집합니다. </li><li> 수동으로 조직 특이 형광 잘 각각의 합성 이미지 (그림 1)을 검사합니다. </li><li> 참고 : 화학 물질의 노출은 이전 실험적인 치료 우물을 관찰에 근무 함을 확인하는 긍정적 인 제어로 시작하는 것이 가장 좋습니다. </li></ol> 96 - 웰 플레이트에있는 태아의 4. 수동 이미지 캡처 참고 : 결과를 확인 AC에 20 배 긴 작동 거리 목표를 사용하려면첩 더 자세한 이미지를 수동으로 (그림 2). <ol><li> 설정 (BF) 20 배 목표와 시야를 사용하여, 긍정적 인 제어 배아를 파악하고 형광 신호가 카메라를 포​​화되지 않은 것을 확인하고, 적절하게 BF 및 GFP 채널에 대한 노출 설정을 설정합니다. </li><li> 수동으로 개별 배아 및 캡처 이미지를 확인합니다. 참고 : 노출 설정이 양성 대조군 배아 선택하고 나면 설정을 변경하지 마십시오. 각 이미지는 균일 한 조건 하에서 촬영 된대로 이것은 형광 강도의 비교를 허용한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

이 프로토콜은 제브라 피쉬 배아에 자동으로 이미지 조직 특이 형광을 간단한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 자이스의 Axio 옵저버를 사용하여 개발되었습니다. Z1은 선 블루 2011 소프트웨어와 함께, 그러나이 기술은 합성 이미지를 만들 수 타일링을 수행 할 수있는 자동화 된 무대와 현미경 제어 소프트웨어와 함께 모든 거꾸로 현미경을 사용하여 적용 할 수 있습니다. 전동 무대 거꾸로 현미경?...

형질 전환 제브라 피쉬는 섬유 아세포 성장 1, 레티노 산 2 인자 라이브 배아, 3 에스트로겐과 같은 경로를, 신호의 활동의 직접적인 시각화 수 있도록 개발되었다. 이러한 도구는 (형광 강도의 변화로 정량) 신호 전달 경로를 교란 화학 물질 또는 조직 특이하게 4 (형광 현지화의 변화)에 신호를 변조 화학 물질에 대한 검사를 가능하게합니다. 자동 이미지 캡처는 크게 5,6 화학 화면의 처리량을 증가시킨다. 라이브 제브라 피쉬의 자동 분석 형광 종종 고가의 전문 장비에 의존 화면. 소위 높은 콘텐츠 심사는 높은 해상도, 양적 이미징하지만, 공 초점 현미경 7,8에 장착 된 특수 플레이트 리더를 사용하는 비용의 혜택을 제공합니다. 이 방법의 목적은 제브라 피쉬 배아 자동 분석 조직 특이 형광하다표준 표면 형광 현미경을 사용하여 96 - 웰 플레이트에. 조직 특이 형광이 기술을 사용하여 구분할 수 있습니다 전문 플레이트 리더 또는 높은 콘텐츠 검사 장치에 대한 액세스를 부족 실험실을위한 합리적인 방법이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 3 일 포스트 수정 (DPF)에서 조직 특정 에스트로겐 수용체 (ER) 라이브 제브라 피쉬의 효능을 감지하는 자동화 이미징을 사용합니다. 유전자 변형 라인의 Tg (5xERE : GFP) c262/c262 녹색 형광 단백질 (GFP)의 상류에 5 탠덤 에스트로겐 반응 요소의 DNA 시퀀스 (ERE)을 포함 3. 리간드의 부재에서, ER로는 일반적으로 비활성이다. 리간드 결합은 수용체가 ERE DNA를 결합하여 전사 9를 조절 할 수 있도록 구조적 변화를 트리거합니다. 5xERE : GFP 물고기 ER 변조기 화학 라이브러리를 화면으로 사용할 수 있으며, 에스트로겐 오염 물질에 대한 환경 물 샘플을 선별하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

제브라 피쉬 배아는 작은 분자의 대규모 스크리닝을위한 강력한 도구입니다. 형광 리포터 단백질을 표현 형질 전환 지브라 피쉬 자주 유전자 발현을 조절하는 물질을 식별하는 데 사용된다. 라이브 제브라 피쉬에서 형광을 분석 실험 화학의 화면은 종종 높은 콘텐츠 심사를 위해 고가의 전문 장비에 의존하고 있습니다. 우리는 모터 단계 자동으로 이미지 제브라 피쉬 배아에 함께 표준 표면 형광 현미경을 사용하여 프로 시저를 설명하고 조직 특이 형광을 감지합니다. GFP의 발현을 통해 에스트로겐 수용체의 활동을보고 형질 전환 제브라 피쉬를 사용하여, 우리는 조직 특정 방식으로 기자를 활성화 에스트로겐 수용체 리간드에 대한 화면으로 반 자동화 된 절차를 개발했다. 이 비디오에서 우리는 96 - 웰 플레이트에 24-48시간 포스트 수정 (HPF)에서 제브라 피쉬 배아으로 배열 및 에스트로겐 수용체를 바인딩 작은 분자를 추가하는 절차에 대해 설명합니다. 72-96 HPF에서, 각각의 이미지를 잘에서전체 판을 자동으로 수집 및 수동으로 조직 특이 형광을 위해 검열된다. 이 프로토콜은 아니지만 간에서의 심장 판막의 수용체를 활성화 에스트로겐을 감지하는 능력을 보여준다.

그림 1은 96 - 웰 플레이트의 각각의 우물에서 합성 이미지를 보여줍니다. 각 합성 이미지는 5 % 이미지 중첩 59 개별 이미지로 구성되어 있습니다. 라이브 제브라 피쉬가 아니라 각 내에서 무작위로 지향, 아직 우리가 간에서 중심에 형광을 구별 할 수있게되어 있습니다. 시야 이미지는 제브라 피쉬의 방향을 평가하고, 형태 학적 이상 (그림 1A와 1C)를 시각화에 대한 참조로?...

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Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.5K 조회수.  University of Alabama at Birmingham.  제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다. 

비디오: Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

연구

생물학

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

작은 하트의 세미 - 자동 광학 도면 분석

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...