친절 neurogenin1 기자 라인을 제공 UWE Strahle하고, Vyacheslav Kalchenko, 더글러스 루츠, 그리고 두 광자 uncaging와 함께 기술적 조언 및 지원 레오 Roitman,, Maayan Tahor 및 기술 지원 Suliman Elsadin 감사 그림 그래픽 Genia 브로드 스키에 의한 아르 이 원고에 대한 의견을 아모스 Gutnick. 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 928/08)와 해리엇 &amp; 마르셀 데커 재단, Levkowitz 실험실의 연구는 독일 - 이스라엘 재단 (부여 번호 2,007분의 183)에 의해 지원됩니다. GL은 바이오 메디컬 연구에 타우 경력 개발 위원장의 재직입니다.

우리는 갇힌 플루오레신를 사용하여 셀 라벨링의 프로토콜을 설명하지만, 다른 사진 activatable 염료와 단백질은 비슷하게 사용할 수 있습니다. 1. 갇힌 플루오레신의 분사 <ol><li> Dextran - 복합 4,5 - dimethoxy - 2 - nitrobenzyl (DMNB) 플루오레신를 (10,000 MW dextran, 음이온, Invitrogen, 분자 프로브, 칼스 배드, CA 갇힌의 5 % 주식 솔루션 (5mg 갇힌 - 플루오레신 / 100 μL 0.2M KCl) 준비 , 고양이. 아니. D - 3310). -20 ° C로 나누어지는 및 저장 DMNB - 갇힌 플루오레신은 빛에 민감하고 어둠에 보관해야합니다. </li><li> 로 &quot;zebrafish 도서&quot;1에서 설명한 1% 아가로 오스 (시그마, 세인트 루이스, MO, 고양이. 아니. A9539)로 만든 주사 트러프를 준비합니다. </li><li> 100 X E3 재고 솔루션을 diluting하여 E3 중간 2 리터를 준비합니다. </li><li> 주입 전에 저녁에 photoactivati​​on의 대상 세포를 집중하는 데 사용하는 가시 형광 랜드마크를 (GFP, RFP 등) 표현 원하는 유전자 변형 라인의 여성 (S)에서 남성 (들)을 분리 교배 새장을 준비합니다. </li><li> micropipette 풀러를 (서터 악기, 노바토, CA, P - 97)를 사용 모세관 주입 바늘을 (필라멘트와 얇은 벽 유리 모세 혈관, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 고양이. 아니. TW100F - 6) 준비. </li><li> 얼음에 갇힌 플루오레신을 5 % 나누어지는를 녹여. </li><li> 1 % 최종 농도 0.2M KCl에 5% 갇힌 플루오레신 재고 솔루션을 희석하고, 얼음 계속. 빛의 노출을 피하십시오. </li><li> 설치 짝짓기는 4 단계에서 준비 십자가. </li><li> 즉시 그들이 낳은 그대로 수정된 달걀을 수집합니다. 아가로 오스의 사출 성형에 동양 한 세포 단계의 배아는 E3 1 입혔다. </li><li> microloader 팁 (Eppendorf, 함부르크, 독일, 고양이. 아니. 5242 956.003) backfill 1% 갇힌 플루오레신 솔루션 ~ 1 μL와 주사 바늘을 사용합니다. </li><li> 장소에 가스 공급 microinjector (공압 picopump, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, PV820). 부착된 micromanipulator에 바늘로드 </li><li> 2 3nl로 사출 볼륨을 조절하고 세포의 세포질에 직접 갇힌 - 플루오레신을 주입. 실험 50 배아 최소 주사. </li><li> 28.5에서 어둠 속에 배아를 품어 ° 원하는 발달 단계에 E3에서 C. 24 시간 게시물 수정보다 오래된 배아를 분석하는 경우, 착색을 억제하는 (PTU, 시그마, 세인트 루이스, MO, 고양이. 아니. 22290-9) 0.1 % phenylthiourea를 추가합니다. </li></ol> 2. 배아가 장착 <ol><li> (; 주 4 ° C에 저장할 수 있습니다 솔루션 부분을 참조) 신선한 E2 솔루션을 준비합니다. </li><li> E2 매체에 녹아있는 1퍼센트 아가로 오스의 얇은 레이어 코팅 60mm 페트리 요리. </li><li> 2퍼센트 낮은 융점 아가로 오스 (.. 울트라 퓨어 LMP 아가로 오스, Invitrogen, 칼스 배드, CA, 고양이도없는 16,520,100)의 삽입을 준비 : 끓는까지 마이크 로파 가열에 의해 살균 이중 증류수의 아가로 오스를 해산. 가열하는 동안 튜브의 뚜껑을 열어 두세요. 나누어지는 1 microcentrifuge 튜브에 ML 72에서 가열 블록의 유지 ° C. </li><li> 부드럽게 날카로운 집게 (제 5)와 간격 chorion를 당기는하여 태아의 chorions를 제거합니다. (단계 2 참조) 한천 - 코팅 접시에 E2 솔루션 배아 보관하십시오. 그들은 폴리 프로필렌의 pipettes에 충실 수 있으므로 Dechorionated 배아는 화재 - 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 취급해야합니다. 이 배아는 액체 표면 장력에 의해 손상될 수 있습니다로 공기에 dechorionized 배아를 노출하지 마십시오. </li><li> E2의 작은 볼륨이 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 선택된 배아를 수집하고, 60mm 페트리 접시에 배아를 놓으십시오. 배아 옆에 2퍼센트 아가로 오스의 드롭 (~ 150 μL) (3 단계)을 탑재합니다. 신속하게 동질적인 최종 ~ 1 % 아가로 오스의 혼합물을 얻기 위해 두 방울을 섞어 배아는 객관적 렌즈를 직면하고 자사의 지느러미 측면과 해부 현미경의 방향을 사용합니다. </li><li> 아가로 오스가 확정 때까지 기다렸다가 포함된 배아가 액체에 빠져들 때까지 E2 매체를 추가합니다. 이것은 그것이 photoactivati​​on 과정 후 아가로 오스의 공개 수 있으므로 요리마다 하나의 배아를 얻는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. Photoactivati​​on <ol><li> 우리는 자이스 혈구 LSM 510 NLO META 두 광자 조정할 수있는 광대역 (700 - 1020nm) Spectraphysics에서 마이 타이 - HP - femtosecond 레이저가 장착된 현미경을 사용합니다. </li><li> 현미경 접시 홀더에 장착 배아를 놓습니다. 배아의 형광 획기은 40x/0.8W Achroplan 물을 사용하면 목표를 포장되어 시각이다. 우리가 500 550nm의 대역 통과 필터 (BP)과 비 descanned 감지기 (NDD)를 사용하여 다음 단계를 수행하십시오. </li><li> photoactivati​​on 과정에 대한 전제 조건으로 860nm의 2 광자 레이저 파장 (GFP 감지)와 함께 발견 형광 신호의 지느러미 부분에 가장 복부의 이미지 시리즈를 인수함으로써 관심 영역의 공간적 형광 정보를 얻습니다. 이를 위해 충분한 해상도는 각 인수 초점 평면 사이 6μm의 기간을 사용하여 얻을 수있다. </li><li> 대상을 선택photoactivati​​on에 대한 Z - 비행기와 초점에이 지역을 가​​지고. 실험의 목적에 따라 관심의 지역 내에서 또는 GFP 볼 수 밖에 랜드마크 중 하나가 될 수 있습니다. 이 Z - 평면에서 하나의 이미지를 가져가라. 이미지를 저장하고 별도의 창에서 열어 유지. </li><li> 720nm로 두 광자 레이저 파장을 설정하고 레이저는 &#39;수정 표백제&#39;메뉴를 열고 잠금 모드에있을 때. &#39;정의 지역&#39;메뉴를 사용하여 860nm (4 단계)에서 촬영한 이미지에 따라 photoactivati​​on에 대한 관심 (ROI)의 영역을 정의합니다. 그것은 후자 작업은 X, 관찰 필드의 Y 위치를 변화 720nm에 레이저 파장을 이동 후이 이미지에 대한 투자 수익 (ROI)을 선택하는 데있어 매우 중요합니다. </li><li> (9 단계 참조) &#39;편집 표백제&#39;메뉴에서 photoactivati​​on에 대해 다음 매개 변수를 조정 :) 상대 레이저의 파워, 반복 B) 번호, C) 스캔 속도. </li><li> 눌러 &#39;수정 표백제&#39;창에 &#39;블리치&#39;및 레이저 멈출 때까지 기다립니다. </li><li> 860nm로 다시 전환, 결과 photoactivated 재료와 활성화된 도메인의 Z - 폭 (두께) 평가하기 위해 이미지 수집의 두 번째 시리즈의 강도를 평가하는 하나의 평면 이미지를 획득. </li><li> photoactivati​​on에 대해 다음 매개 변수를 고려 : <ol class="lalpha"><li> 레이저 강도와 photoactivati​​on 기간 : 하나는 경험적으로 두 개의 매개 변수를 변화하여 photoactivati​​on을위한 최적의 조건을 결정한다. 상대 레이저의 파워는 음향 광학 변조기 (AOM) 전송에 의해 제어할 수 있습니다. photoactivati​​on의 기간은 반복 및 스캔 속도의 수를 기능입니다. </li><li> uncaged 형광의 포화를 피하기 위해 형광 강도의 선형 범위를 결정합니다. </li><li> uncaged 분자의 형광 강도를 획득하고 photoactivated 복제 2 Z - 축 스팬 사이에 선형 상관 관계가있다. </li></ol></li></ol> 4. Uncaged 플루오레신의 감지 <ol><li> photoactivati​​on 후 28.5에서 어둠 속에서 배아를 인상 ° E2 매체에서 C는 피부 착색의 모양을 방지하기 위해 PTU 0.1 %를 포함. </li><li> 원하는 발달 단계에서, 해부 현미경 아가로 오스의 배아를 제거합니다. 지적 메스를 사용하여 &quot;V&quot;는 배아의 머리쪽으로 향하고있다 있도록 배아 근처 아가로 오스에 &quot;V&quot;모양의 절개를 만듭니다. 배아의 머리 근처에있는 &quot;V&quot;의 시점에서 닫힌 집게를 놓고 부드럽게 배아의 길이를 따라 아가로 오스를 분리하고 중간에 배아를 발표 포셉을 열고 밀고. </li><li> 불타는 광택 파스퇴르 피펫으로 배아를 수집하고 paraformaldehyde (PFA, 1 X PBS, PH 7.2의 4 %)로 수정 4 3 상온에서 시간 또는 하루 중 대한 ° C. </li><li> 정착액 솔루션을 제거하고 실온에서 적어도 5 분 PBST에 2-3 번 씻어. </li><li> 적어도 2 시간을 위해 -20 ° C에서 신선한 메탄올과 부화로 보충, 10 분 100 % 메탄올로 배아를 씻으십시오. </li><li> 80%, 60 %, 40 % 및 20 % PBSTr에 희석 메탄올의 일련의 연속 incubations (5 분 각각)에 의해 배아를 Rehydrate. PBSTr 2 X 10 분 씻으십시오. </li><li> 차단 솔루션을 500 μL에 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> 솔루션을 차단으로 1:500 희석 방지 플루오레신 - 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP = 연합 뉴스) 팹의 조각을 (로체, 팔로 알토, CA, 고양이. 안돼. 11,426,338,910) 추가 4 밤새 품어 ° C (그들 면이 장소 microcentrifuge 튜브) . </li><li> PBST 5 X 15 분 씻으십시오. </li><li> TNT에서 0.2M NaCl 5 분 씻으십시오. </li><li> TNT에서 0.4M NaCl 5 분 씻으십시오. </li><li> 신선한 Prestain 솔루션 3 X 5 분 평형. </li><li> 2 ML Prestain 솔루션에서 한 빠른 레드 타블렛 (로체, 팔로 알토, CA, 고양이. 아니. 11,496,549,001) 디졸브. 그것은 유엔 - 해산 입자를 생략 왓먼 제 2 종이를 사용하여 솔루션을 필터링하는 것이 좋습니다. 또는 솔루션을 스핀 다운하고 맑은 뜨는 액체를 사용합니다. </li><li> 500 μL 패스트 레드 상온에서 어둠 속에 품어 각 튜브에 솔루션, 그리고 모니터 색상 개발 원하는 신호 대 배경 비율이 (몇 시간 20 분)에 도달할 때까지 추가합니다. 배경이 개발하는 경우, 4로 전송 ° C. 부화 한 시간 후에, 새로운 패스트 레드 얼룩 솔루션을 보충. </li><li> 3 X 5 분 얼룩 반응을 중지 PBST로 씻는다. </li><li> 상온에서 4퍼센트 PFA에 20 분 수정. </li><li> PBST 2 X 5 분 씻으십시오. </li><li> 25 %의 일련의 50 %와 PBS의 75 % 글리세롤을 통해 지우기 배아가 배아 때까지 튜브의 아래쪽에 정착하고 있습니다. 배아는 몇 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. Uncaged 지역의 형광 시각화 <ol><li> 장착을위한 현미경의 슬라이드를 준비 : 1 ML의 주사기가 서로 ~ 15mm의 거리에서 배치 슬라이드 맑은 실리콘 그리스 네 가지 명소를 적용 사용합니다. cente에서 배아 마운트R의 75 % 글리세롤 장소 coverslip (제 0; 18x18mm)의 ~ 200 μL에서 상단과 글리세롤 솔루션 슬라이드 사이의 표면을 점유 때까지 부드럽게 실리콘에 대해 그것을 밀어. </li><li> 무대에 탑재된 배아를 놓고 40x 목표를 사용하여 초점에 그것을 가지고. 488nm 아르곤과 여기 소스로 543nm HeNe 레이저를 사용하여 이미지의 공촛점 Z - 시리즈를 취득. </li><li> photoactivatated 도메인의 Z 축 범위는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 uncaged 배아의 3D 재구성을 사용하여 분석하실 수 있습니다. </li></ol> 6. 솔루션 <table border="1"><tbody><tr><td> 100 X E3 </td><td> 174mM NaCl, 21mM KCl, 장총 MgSO 4, 18mM 칼슘 (NO3), 15mM HEPES, pH를 = 7.4. 4 여과하고 저장하여 소독 ° C </td></tr><tr><td> 20 X E2 </td><td> 0.3M NaCl, 10mM KCl, 실온에서 20mM CaCl 2 * 2HOH, 20mM MgSO 4 * 7HOH, 3mM KH 2 PO 4, 0.8mM 나 2 HPO 4 * 2HOH, 여과물 및 저장 </td></tr><tr><td> 1 X E2 </td><td> 이중 증류수 20 X E2를 희석하고 신선한 NaHCO 3 (0.7mM의 최종 농도), 페니실린과 스트렙토 마이신 (페니실린 및 ML 당 100mg 스트렙토 마이신 (Invitrogen의 100U를 포함 한 X의 최종 농도로 희석 펜 strep 솔루션을 만들어 추가 , 칼스 배드, CA, 고양이. 아니. 15140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> 0.1 % PBS에서 트윈 - 20 </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> PBS에 0.​​3 % 트리톤 </td></tr><tr><td> 차단 솔루션 </td><td> 10% BSA, 0.3 % 트리톤, PBS에 1퍼센트 DMSO </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100mM 트리스 - HCL의 산도 - 7.5, 150mM NaCl, 0.5 %를 두 번 증류수에 트윈 - 20 </td></tr><tr><td> Prestain 솔루션 </td><td> 100mM 트리스 - HCL의 산도 - 8.2, 0.4M NaCl, 0.1 %를 두 번 증류수에 트윈 - 20 </td></tr></tbody></table> 7. 대표 결과 생활 zebrafish 배아에서 요원을 photoactivate하는 두 광자 현미경의 사용 예제는 제공됩니다. 비슷한 접근법을 사용 우리는 이전에 zebrafish의 두뇌 2,3에 photoactivated 레이블 신경 progenitors의 혈통을 추적. : 살아있는 본질적인 랜드마크 역할을 GFP transgene 기자, : 그림 1은 neurog1를 들고 zebrafish 배아의 앞쪽에 신경 접시에 갇힌 플루오레신 복합 추적 염료의 photoactivation을 보여줍니다. 배아는 세포 하나의 단계에서 갇힌 플루오레신 주사와 버드 단계에서 아가로 오스에 포함되었습니다. 3 - 5 - 체절 단계 공간 좌표 neurog1로 측정되었습니다 : GFP 형질 전환 배아는 (그림 1A, A &#39;) uncaging에 대한 관심의 영역 (ROI)을 확인합니다. 우리는 신경 플레이트 (그림 1B, B &#39;)의 특정 도메인에서 플루오레신 혈통의 추적기 uncaged. 그 후,이 주어진 표시 신경 전구 하위 도메인의 운명은 uncaged 플루오레신 (그림 1C, C &#39;)의 immunostaining으로 prim5 (24 시간 게시물 수정) 단계에서 결정되었다. 두 광자 레이저 uncaging의 범위는, uncaged 형광과 photoactivated 도메인 (Z - 스팬)의 두께의 강도 즉, 두 개의 매개 변수를 조정하여 제어할 수 : 레이저 강도와 기간. 후자는 (; 러섹 - 블럼 2009 년 제 3 단계 9 참조) 반복 번호와 스캔 속도의 조절에 의해 제어할 수 있습니다. 그림 1에 표시된 예제에서, 우리는 25.6 μsec / 픽셀의 상대적인 레이저 12 % AOM 전송 전력, 20 반복과 속도를 검사를 사용합니다. 이러한 설정을 사용하여 우리는 9-10 세포와 30μm의 photoactivated Z - 스팬 (~ 1-2 셀 행)이있는 투자 수익 (ROI)을 표시. <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 두 광자 현미경을 사용하여 라이브 zebrafish 배아에 갇힌 플루오레신의 photoactivation의 대표 결과. 도식 일러스트 (AC)과 photoactivati​​on 프로세스의 대표 이미지 (A&#39; - C &#39;). 한 세포 단계에서 갇힌 플루오레신 추적 염료를 주사 맞은 (GFP : neurog1) zebrafish 배아를 (A, A &#39;) neurogenin - 1 프로 모터의 제어하에 표현 GFP 살고 있습니다. 3-5에서 - 체절 단계, forebrain primordium (diencephalon)의 이산 지역은 photoactivated되었으며 uncaged 플루오레신 추적 염료 (B, B &#39;) 감지 수 있습니다. photoactivati​​on 절차 이후에, 배아는 ° C와 uncaged 플루오레신을 포함한 뇌 세포가 24 시간 게시물 수정 (; C, C &#39;HPF)에서 안티 플루오레신 immunostaining에 의해 추적되었다 28.5에 incubated했다. 디엔, Diencephalon;. 전화, Telencephalon..

<ol>
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사진 activatable 화합물은 누구 함수들은 생물 학적 또는 화학적으로 활성화된 상태로 분자를 변환하는 광화학 반응을 유도하는 특정 파장 (보통 UV)와 조명까지 가면됩니다 분자 수 있습니다. 정품 인증이 정확하게 빛을 자신의 노출을 제한함으로써 temporally하고 공간 제어 수 있으므로 이러한 프로브는 세포 생물학 연구에 매우 강력한 도구를 제공합니다. 다중 광자 현미경의 ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3310</td>
<td>molecular probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose for injection trough and coated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9539</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic picopump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>22290-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose for embryo mounting</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra Pure LMP agarose</td>
<td>16520100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426338910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11496549001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos

살아있는 생물의 목표 화합물의 Photoactivati​​on는 배아 개발, 세포 신호 성인 생리학 등 다양한 생물 학적 프로세스를 연구하는 귀중한 접근을 입증했다. 이러한 측면에서, 다중 광자 현미경의 사용은 하나의 세포 해상도 깊은 조직에서 주어진 빛의 반응 요원의 양적 photoactivati​​on 수 있습니다. zebrafish 배아는 광학 투명으로, 그들의 발전은 생체내에서 모니터링할 수 있습니다. 이러한 특성은 zebrafish 집중 조명하여 화학 약품과 단백질의 다양한 활동을 제어하기위한 완벽한 모델​​ 생물합니다. 여기 차례로 우리가 살고 zebrafish의 배아에서 세포의 운명을 따를 수 있습니다 화학적 갇힌 플루오레신의 활성화를 유도하는 두 광자 현미경의 사용을 설명합니다. 우리는 관심의 세포를 찾아 정확하게 대상으로 라이브 유전자 랜드마크 (GFP)을 표현 배아를 사용합니다. 이 절차는 마찬가지로 단백질, 호르몬, 작은 분자 및 기타 갇힌 화합물의 정확한 빛의 유도 활성을 위해 사용될 수 있습니다.

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Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

two-photon-based-photoactivation-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K 조회수.  Weizmann Institute of Science. Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.

비디오: Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

연구

생물학

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivation