친절 neurogenin1 기자 라인을 제공 UWE Strahle하고, Vyacheslav Kalchenko, 더글러스 루츠, 그리고 두 광자 uncaging와 함께 기술적 조언 및 지원 레오 Roitman,, Maayan Tahor 및 기술 지원 Suliman Elsadin 감사 그림 그래픽 Genia 브로드 스키에 의한 아르 이 원고에 대한 의견을 아모스 Gutnick. 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 928/08)와 해리엇 &amp; 마르셀 데커 재단, Levkowitz 실험실의 연구는 독일 - 이스라엘 재단 (부여 번호 2,007분의 183)에 의해 지원됩니다. GL은 바이오 메디컬 연구에 타우 경력 개발 위원장의 재직입니다.

우리는 갇힌 플루오레신를 사용하여 셀 라벨링의 프로토콜을 설명하지만, 다른 사진 activatable 염료와 단백질은 비슷하게 사용할 수 있습니다. 1. 갇힌 플루오레신의 분사 <ol><li> Dextran - 복합 4,5 - dimethoxy - 2 - nitrobenzyl (DMNB) 플루오레신를 (10,000 MW dextran, 음이온, Invitrogen, 분자 프로브, 칼스 배드, CA 갇힌의 5 % 주식 솔루션 (5mg 갇힌 - 플루오레신 / 100 μL 0.2M KCl) 준비 , 고양이. 아니. D - 3310). -20 ° C로 나누어지는 및 저장 DMNB - 갇힌 플루오레신은 빛에 민감하고 어둠에 보관해야합니다. </li><li> 로 &quot;zebrafish 도서&quot;1에서 설명한 1% 아가로 오스 (시그마, 세인트 루이스, MO, 고양이. 아니. A9539)로 만든 주사 트러프를 준비합니다. </li><li> 100 X E3 재고 솔루션을 diluting하여 E3 중간 2 리터를 준비합니다. </li><li> 주입 전에 저녁에 photoactivati​​on의 대상 세포를 집중하는 데 사용하는 가시 형광 랜드마크를 (GFP, RFP 등) 표현 원하는 유전자 변형 라인의 여성 (S)에서 남성 (들)을 분리 교배 새장을 준비합니다. </li><li> micropipette 풀러를 (서터 악기, 노바토, CA, P - 97)를 사용 모세관 주입 바늘을 (필라멘트와 얇은 벽 유리 모세 혈관, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 고양이. 아니. TW100F - 6) 준비. </li><li> 얼음에 갇힌 플루오레신을 5 % 나누어지는를 녹여. </li><li> 1 % 최종 농도 0.2M KCl에 5% 갇힌 플루오레신 재고 솔루션을 희석하고, 얼음 계속. 빛의 노출을 피하십시오. </li><li> 설치 짝짓기는 4 단계에서 준비 십자가. </li><li> 즉시 그들이 낳은 그대로 수정된 달걀을 수집합니다. 아가로 오스의 사출 성형에 동양 한 세포 단계의 배아는 E3 1 입혔다. </li><li> microloader 팁 (Eppendorf, 함부르크, 독일, 고양이. 아니. 5242 956.003) backfill 1% 갇힌 플루오레신 솔루션 ~ 1 μL와 주사 바늘을 사용합니다. </li><li> 장소에 가스 공급 microinjector (공압 picopump, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, PV820). 부착된 micromanipulator에 바늘로드 </li><li> 2 3nl로 사출 볼륨을 조절하고 세포의 세포질에 직접 갇힌 - 플루오레신을 주입. 실험 50 배아 최소 주사. </li><li> 28.5에서 어둠 속에 배아를 품어 ° 원하는 발달 단계에 E3에서 C. 24 시간 게시물 수정보다 오래된 배아를 분석하는 경우, 착색을 억제하는 (PTU, 시그마, 세인트 루이스, MO, 고양이. 아니. 22290-9) 0.1 % phenylthiourea를 추가합니다. </li></ol> 2. 배아가 장착 <ol><li> (; 주 4 ° C에 저장할 수 있습니다 솔루션 부분을 참조) 신선한 E2 솔루션을 준비합니다. </li><li> E2 매체에 녹아있는 1퍼센트 아가로 오스의 얇은 레이어 코팅 60mm 페트리 요리. </li><li> 2퍼센트 낮은 융점 아가로 오스 (.. 울트라 퓨어 LMP 아가로 오스, Invitrogen, 칼스 배드, CA, 고양이도없는 16,520,100)의 삽입을 준비 : 끓는까지 마이크 로파 가열에 의해 살균 이중 증류수의 아가로 오스를 해산. 가열하는 동안 튜브의 뚜껑을 열어 두세요. 나누어지는 1 microcentrifuge 튜브에 ML 72에서 가열 블록의 유지 ° C. </li><li> 부드럽게 날카로운 집게 (제 5)와 간격 chorion를 당기는하여 태아의 chorions를 제거합니다. (단계 2 참조) 한천 - 코팅 접시에 E2 솔루션 배아 보관하십시오. 그들은 폴리 프로필렌의 pipettes에 충실 수 있으므로 Dechorionated 배아는 화재 - 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 취급해야합니다. 이 배아는 액체 표면 장력에 의해 손상될 수 있습니다로 공기에 dechorionized 배아를 노출하지 마십시오. </li><li> E2의 작은 볼륨이 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 선택된 배아를 수집하고, 60mm 페트리 접시에 배아를 놓으십시오. 배아 옆에 2퍼센트 아가로 오스의 드롭 (~ 150 μL) (3 단계)을 탑재합니다. 신속하게 동질적인 최종 ~ 1 % 아가로 오스의 혼합물을 얻기 위해 두 방울을 섞어 배아는 객관적 렌즈를 직면하고 자사의 지느러미 측면과 해부 현미경의 방향을 사용합니다. </li><li> 아가로 오스가 확정 때까지 기다렸다가 포함된 배아가 액체에 빠져들 때까지 E2 매체를 추가합니다. 이것은 그것이 photoactivati​​on 과정 후 아가로 오스의 공개 수 있으므로 요리마다 하나의 배아를 얻는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. Photoactivati​​on <ol><li> 우리는 자이스 혈구 LSM 510 NLO META 두 광자 조정할 수있는 광대역 (700 - 1020nm) Spectraphysics에서 마이 타이 - HP - femtosecond 레이저가 장착된 현미경을 사용합니다. </li><li> 현미경 접시 홀더에 장착 배아를 놓습니다. 배아의 형광 획기은 40x/0.8W Achroplan 물을 사용하면 목표를 포장되어 시각이다. 우리가 500 550nm의 대역 통과 필터 (BP)과 비 descanned 감지기 (NDD)를 사용하여 다음 단계를 수행하십시오. </li><li> photoactivati​​on 과정에 대한 전제 조건으로 860nm의 2 광자 레이저 파장 (GFP 감지)와 함께 발견 형광 신호의 지느러미 부분에 가장 복부의 이미지 시리즈를 인수함으로써 관심 영역의 공간적 형광 정보를 얻습니다. 이를 위해 충분한 해상도는 각 인수 초점 평면 사이 6μm의 기간을 사용하여 얻을 수있다. </li><li> 대상을 선택photoactivati​​on에 대한 Z - 비행기와 초점에이 지역을 가​​지고. 실험의 목적에 따라 관심의 지역 내에서 또는 GFP 볼 수 밖에 랜드마크 중 하나가 될 수 있습니다. 이 Z - 평면에서 하나의 이미지를 가져가라. 이미지를 저장하고 별도의 창에서 열어 유지. </li><li> 720nm로 두 광자 레이저 파장을 설정하고 레이저는 &#39;수정 표백제&#39;메뉴를 열고 잠금 모드에있을 때. &#39;정의 지역&#39;메뉴를 사용하여 860nm (4 단계)에서 촬영한 이미지에 따라 photoactivati​​on에 대한 관심 (ROI)의 영역을 정의합니다. 그것은 후자 작업은 X, 관찰 필드의 Y 위치를 변화 720nm에 레이저 파장을 이동 후이 이미지에 대한 투자 수익 (ROI)을 선택하는 데있어 매우 중요합니다. </li><li> (9 단계 참조) &#39;편집 표백제&#39;메뉴에서 photoactivati​​on에 대해 다음 매개 변수를 조정 :) 상대 레이저의 파워, 반복 B) 번호, C) 스캔 속도. </li><li> 눌러 &#39;수정 표백제&#39;창에 &#39;블리치&#39;및 레이저 멈출 때까지 기다립니다. </li><li> 860nm로 다시 전환, 결과 photoactivated 재료와 활성화된 도메인의 Z - 폭 (두께) 평가하기 위해 이미지 수집의 두 번째 시리즈의 강도를 평가하는 하나의 평면 이미지를 획득. </li><li> photoactivati​​on에 대해 다음 매개 변수를 고려 : <ol class="lalpha"><li> 레이저 강도와 photoactivati​​on 기간 : 하나는 경험적으로 두 개의 매개 변수를 변화하여 photoactivati​​on을위한 최적의 조건을 결정한다. 상대 레이저의 파워는 음향 광학 변조기 (AOM) 전송에 의해 제어할 수 있습니다. photoactivati​​on의 기간은 반복 및 스캔 속도의 수를 기능입니다. </li><li> uncaged 형광의 포화를 피하기 위해 형광 강도의 선형 범위를 결정합니다. </li><li> uncaged 분자의 형광 강도를 획득하고 photoactivated 복제 2 Z - 축 스팬 사이에 선형 상관 관계가있다. </li></ol></li></ol> 4. Uncaged 플루오레신의 감지 <ol><li> photoactivati​​on 후 28.5에서 어둠 속에서 배아를 인상 ° E2 매체에서 C는 피부 착색의 모양을 방지하기 위해 PTU 0.1 %를 포함. </li><li> 원하는 발달 단계에서, 해부 현미경 아가로 오스의 배아를 제거합니다. 지적 메스를 사용하여 &quot;V&quot;는 배아의 머리쪽으로 향하고있다 있도록 배아 근처 아가로 오스에 &quot;V&quot;모양의 절개를 만듭니다. 배아의 머리 근처에있는 &quot;V&quot;의 시점에서 닫힌 집게를 놓고 부드럽게 배아의 길이를 따라 아가로 오스를 분리하고 중간에 배아를 발표 포셉을 열고 밀고. </li><li> 불타는 광택 파스퇴르 피펫으로 배아를 수집하고 paraformaldehyde (PFA, 1 X PBS, PH 7.2의 4 %)로 수정 4 3 상온에서 시간 또는 하루 중 대한 ° C. </li><li> 정착액 솔루션을 제거하고 실온에서 적어도 5 분 PBST에 2-3 번 씻어. </li><li> 적어도 2 시간을 위해 -20 ° C에서 신선한 메탄올과 부화로 보충, 10 분 100 % 메탄올로 배아를 씻으십시오. </li><li> 80%, 60 %, 40 % 및 20 % PBSTr에 희석 메탄올의 일련의 연속 incubations (5 분 각각)에 의해 배아를 Rehydrate. PBSTr 2 X 10 분 씻으십시오. </li><li> 차단 솔루션을 500 μL에 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> 솔루션을 차단으로 1:500 희석 방지 플루오레신 - 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP = 연합 뉴스) 팹의 조각을 (로체, 팔로 알토, CA, 고양이. 안돼. 11,426,338,910) 추가 4 밤새 품어 ° C (그들 면이 장소 microcentrifuge 튜브) . </li><li> PBST 5 X 15 분 씻으십시오. </li><li> TNT에서 0.2M NaCl 5 분 씻으십시오. </li><li> TNT에서 0.4M NaCl 5 분 씻으십시오. </li><li> 신선한 Prestain 솔루션 3 X 5 분 평형. </li><li> 2 ML Prestain 솔루션에서 한 빠른 레드 타블렛 (로체, 팔로 알토, CA, 고양이. 아니. 11,496,549,001) 디졸브. 그것은 유엔 - 해산 입자를 생략 왓먼 제 2 종이를 사용하여 솔루션을 필터링하는 것이 좋습니다. 또는 솔루션을 스핀 다운하고 맑은 뜨는 액체를 사용합니다. </li><li> 500 μL 패스트 레드 상온에서 어둠 속에 품어 각 튜브에 솔루션, 그리고 모니터 색상 개발 원하는 신호 대 배경 비율이 (몇 시간 20 분)에 도달할 때까지 추가합니다. 배경이 개발하는 경우, 4로 전송 ° C. 부화 한 시간 후에, 새로운 패스트 레드 얼룩 솔루션을 보충. </li><li> 3 X 5 분 얼룩 반응을 중지 PBST로 씻는다. </li><li> 상온에서 4퍼센트 PFA에 20 분 수정. </li><li> PBST 2 X 5 분 씻으십시오. </li><li> 25 %의 일련의 50 %와 PBS의 75 % 글리세롤을 통해 지우기 배아가 배아 때까지 튜브의 아래쪽에 정착하고 있습니다. 배아는 몇 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. Uncaged 지역의 형광 시각화 <ol><li> 장착을위한 현미경의 슬라이드를 준비 : 1 ML의 주사기가 서로 ~ 15mm의 거리에서 배치 슬라이드 맑은 실리콘 그리스 네 가지 명소를 적용 사용합니다. cente에서 배아 마운트R의 75 % 글리세롤 장소 coverslip (제 0; 18x18mm)의 ~ 200 μL에서 상단과 글리세롤 솔루션 슬라이드 사이의 표면을 점유 때까지 부드럽게 실리콘에 대해 그것을 밀어. </li><li> 무대에 탑재된 배아를 놓고 40x 목표를 사용하여 초점에 그것을 가지고. 488nm 아르곤과 여기 소스로 543nm HeNe 레이저를 사용하여 이미지의 공촛점 Z - 시리즈를 취득. </li><li> photoactivatated 도메인의 Z 축 범위는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 uncaged 배아의 3D 재구성을 사용하여 분석하실 수 있습니다. </li></ol> 6. 솔루션 <table border="1"><tbody><tr><td> 100 X E3 </td><td> 174mM NaCl, 21mM KCl, 장총 MgSO 4, 18mM 칼슘 (NO3), 15mM HEPES, pH를 = 7.4. 4 여과하고 저장하여 소독 ° C </td></tr><tr><td> 20 X E2 </td><td> 0.3M NaCl, 10mM KCl, 실온에서 20mM CaCl 2 * 2HOH, 20mM MgSO 4 * 7HOH, 3mM KH 2 PO 4, 0.8mM 나 2 HPO 4 * 2HOH, 여과물 및 저장 </td></tr><tr><td> 1 X E2 </td><td> 이중 증류수 20 X E2를 희석하고 신선한 NaHCO 3 (0.7mM의 최종 농도), 페니실린과 스트렙토 마이신 (페니실린 및 ML 당 100mg 스트렙토 마이신 (Invitrogen의 100U를 포함 한 X의 최종 농도로 희석 펜 strep 솔루션을 만들어 추가 , 칼스 배드, CA, 고양이. 아니. 15140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> 0.1 % PBS에서 트윈 - 20 </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> PBS에 0.​​3 % 트리톤 </td></tr><tr><td> 차단 솔루션 </td><td> 10% BSA, 0.3 % 트리톤, PBS에 1퍼센트 DMSO </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100mM 트리스 - HCL의 산도 - 7.5, 150mM NaCl, 0.5 %를 두 번 증류수에 트윈 - 20 </td></tr><tr><td> Prestain 솔루션 </td><td> 100mM 트리스 - HCL의 산도 - 8.2, 0.4M NaCl, 0.1 %를 두 번 증류수에 트윈 - 20 </td></tr></tbody></table> 7. 대표 결과 생활 zebrafish 배아에서 요원을 photoactivate하는 두 광자 현미경의 사용 예제는 제공됩니다. 비슷한 접근법을 사용 우리는 이전에 zebrafish의 두뇌 2,3에 photoactivated 레이블 신경 progenitors의 혈통을 추적. : 살아있는 본질적인 랜드마크 역할을 GFP transgene 기자, : 그림 1은 neurog1를 들고 zebrafish 배아의 앞쪽에 신경 접시에 갇힌 플루오레신 복합 추적 염료의 photoactivation을 보여줍니다. 배아는 세포 하나의 단계에서 갇힌 플루오레신 주사와 버드 단계에서 아가로 오스에 포함되었습니다. 3 - 5 - 체절 단계 공간 좌표 neurog1로 측정되었습니다 : GFP 형질 전환 배아는 (그림 1A, A &#39;) uncaging에 대한 관심의 영역 (ROI)을 확인합니다. 우리는 신경 플레이트 (그림 1B, B &#39;)의 특정 도메인에서 플루오레신 혈통의 추적기 uncaged. 그 후,이 주어진 표시 신경 전구 하위 도메인의 운명은 uncaged 플루오레신 (그림 1C, C &#39;)의 immunostaining으로 prim5 (24 시간 게시물 수정) 단계에서 결정되었다. 두 광자 레이저 uncaging의 범위는, uncaged 형광과 photoactivated 도메인 (Z - 스팬)의 두께의 강도 즉, 두 개의 매개 변수를 조정하여 제어할 수 : 레이저 강도와 기간. 후자는 (; 러섹 - 블럼 2009 년 제 3 단계 9 참조) 반복 번호와 스캔 속도의 조절에 의해 제어할 수 있습니다. 그림 1에 표시된 예제에서, 우리는 25.6 μsec / 픽셀의 상대적인 레이저 12 % AOM 전송 전력, 20 반복과 속도를 검사를 사용합니다. 이러한 설정을 사용하여 우리는 9-10 세포와 30μm의 photoactivated Z - 스팬 (~ 1-2 셀 행)이있는 투자 수익 (ROI)을 표시. <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 두 광자 현미경을 사용하여 라이브 zebrafish 배아에 갇힌 플루오레신의 photoactivation의 대표 결과. 도식 일러스트 (AC)과 photoactivati​​on 프로세스의 대표 이미지 (A&#39; - C &#39;). 한 세포 단계에서 갇힌 플루오레신 추적 염료를 주사 맞은 (GFP : neurog1) zebrafish 배아를 (A, A &#39;) neurogenin - 1 프로 모터의 제어하에 표현 GFP 살고 있습니다. 3-5에서 - 체절 단계, forebrain primordium (diencephalon)의 이산 지역은 photoactivated되었으며 uncaged 플루오레신 추적 염료 (B, B &#39;) 감지 수 있습니다. photoactivati​​on 절차 이후에, 배아는 ° C와 uncaged 플루오레신을 포함한 뇌 세포가 24 시간 게시물 수정 (; C, C &#39;HPF)에서 안티 플루오레신 immunostaining에 의해 추적되었다 28.5에 incubated했다. 디엔, Diencephalon;. 전화, Telencephalon..

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사진 activatable 화합물은 누구 함수들은 생물 학적 또는 화학적으로 활성화된 상태로 분자를 변환하는 광화학 반응을 유도하는 특정 파장 (보통 UV)와 조명까지 가면됩니다 분자 수 있습니다. 정품 인증이 정확하게 빛을 자신의 노출을 제한함으로써 temporally하고 공간 제어 수 있으므로 이러한 프로브는 세포 생물학 연구에 매우 강력한 도구를 제공합니다. 다중 광자 현미경의 ...

<table><tbody><tr><td>Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic)</td><td>Invitrogen</td><td>D-3310</td><td>molecular probes</td></tr><tr><td>Agarose for injection trough and coated plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tip</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic picopump</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22290-9</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose for embryo mounting</td><td>Ultra Pure LMP agarose</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td><td>Roche Group</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red</td><td>Roche Group</td><td>11496549001</td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos

살아있는 생물의 목표 화합물의 Photoactivati​​on는 배아 개발, 세포 신호 성인 생리학 등 다양한 생물 학적 프로세스를 연구하는 귀중한 접근을 입증했다. 이러한 측면에서, 다중 광자 현미경의 사용은 하나의 세포 해상도 깊은 조직에서 주어진 빛의 반응 요원의 양적 photoactivati​​on 수 있습니다. zebrafish 배아는 광학 투명으로, 그들의 발전은 생체내에서 모니터링할 수 있습니다. 이러한 특성은 zebrafish 집중 조명하여 화학 약품과 단백질의 다양한 활동을 제어하기위한 완벽한 모델​​ 생물합니다. 여기 차례로 우리가 살고 zebrafish의 배아에서 세포의 운명을 따를 수 있습니다 화학적 갇힌 플루오레신의 활성화를 유도하는 두 광자 현미경의 사용을 설명합니다. 우리는 관심의 세포를 찾아 정확하게 대상으로 라이브 유전자 랜드마크 (GFP)을 표현 배아를 사용합니다. 이 절차는 마찬가지로 단백질, 호르몬, 작은 분자 및 기타 갇힌 화합물의 정확한 빛의 유도 활성을 위해 사용될 수 있습니다.

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Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.5K 조회수.  Weizmann Institute of Science. Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.

비디오: Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

연구

발생학

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

생물학

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Larval zebrafish are emerging as a model for describing the development and function of simple neural circuits. Due to their external fertilization, rapid development, and translucency, zebrafish are particularly well suited for optogenetic approaches to investigate neural circuit function. In this approach, light-sensitive ion channels are expressed in specific neurons, enabling the experimenter to activate or inhibit them at will and thus assess their contribution to specific behaviors. Applying these methods in larval zebrafish is conceptually simple but requires the optimization of technical details. Here we demonstrate a procedure for expressing a channelrhodopsin variant in larval zebrafish somatosensory neurons, photo-activating single cells, and recording the resulting behaviors. By introducing a few modifications to previously established methods, this approach could be used to elicit behavioral responses from single neurons activated up to at least 4 days post-fertilization (dpf). Specifically, we created a transgene using a somatosensory neuron enhancer, CREST3, to drive the expression of the tagged channelrhodopsin variant, ChEF-tdTomato. Injecting this transgene into 1-cell stage embryos results in mosaic expression in somatosensory neurons, which can be imaged with confocal microscopy. Illuminating identified cells in these animals with light from a 473 nm DPSS laser, guided through a fiber optic cable, elicits behaviors that can be recorded with a high-speed video camera and analyzed quantitatively. This technique could be adapted to study behaviors elicited by activating any zebrafish neuron. Combining this approach with genetic or pharmacological perturbations will be a powerful way to investigate circuit formation and function.

Optogenetic techniques have made it possible to study the contribution of specific neurons to behavior. We describe a method in larval zebrafish for activating single somatosensory neurons expressing a channelrhodopsin variant (ChEF) with a diode-pumped solid state (DPSS) laser and recording the elicited behaviors with a high-speed video camera.

요리사 tdTomato를 사용하여 Zebrafish Somatosensory의 뉴런의 Optogenetic 활성화

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

신경과학

제브라피시에서 광유전학적 신호전달 조작을 이용한 개발 조사

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

저자 스포트라이트: 세포 운명 결정을 해독하기 위해 제브라피시 배아의 신호 전달 조작 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivation

요약

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라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

요리사 tdTomato를 사용하여 Zebrafish Somatosensory의 뉴런의 Optogenetic 활성화

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

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라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

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생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

요리사 tdTomato를 사용하여 Zebrafish Somatosensory의 뉴런의 Optogenetic 활성화

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivation