우리는 현지 시간 저속 영상에 대한 장착에 대한 조언을 조직 손상, 캐시 Joubin 및 토론을위한 Sagasti 및 Portera - Cailliau 실험실을 생성하기 위해 두 광자 현미경을 사용하여 초기 조언 마크 데라 사키 감사합니다. 초기 실험은 우즈 홀, MA에있는 해양 생물 연구소에서 그라스 재단 연구원처럼 의해 수행되었다. Sagasti 실험실 작업은 화이트홀 재단 Klingenstein 재단, 그리고 생명 공학 버로우즈 웰컴 기금 경력 수상의 보조금에 의해 지원되었다.

1 부 : 장기 이미징 장착 zebrafish의 배아 <ol><li> 삽입을위한 1퍼센트 낮은 용해 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 작은 튜브와 섭씨 42 도에 가열 블록에 저장에 전자렌지, 나누어지는에서 가열하여 DI 물의 아가로 오스를 디졸브. </li><li> 이미징을위한 배아를 선택하고 부드럽게 집게로 분리 chorion를 당기는하여 chorions를 제거합니다. 배아는 색소의 형성을 억제하기 위해 22-24시간 포스트 수정 (HPF)에서 5 % PTU 링거스 솔루션에 삽입할 수 있습니다. 이것은 영상의 선명도를 향상시키고 감각 axons의 2 광자 axotomies를 수행하는 것이 필수적입니다. 자연 색소가 양식을 수있다면, autofluorescence는 두 광자 현미경에 axons를 가린다. zebrafish에 대한 솔루션은 116 MM NaCl, 2.9 KCl MM 1.8 MM CaCl 2, 5mM HEPES, pH를 7.2이 포함되어 있습니다 링거스. </li><li> PTU 링거스에 ~ 0.02 % tricaine을 추가하여 배아를 마취. 확실히 동물이 진행하기 전에 터치에 반응하지 않습니다하십시오. </li><li> 유리 또는 테플론 반지의 한쪽으로 진공 그리스를 적용하고 유리 커버 슬립에 그것을 고정하여 장기 이미징 챔버를 준비합니다. </li><li> 많은 PTU 링거스의를 전송하지를 돌보는 유리 pipet으로 42도 아가로 오스 솔루션을 하나의 배아를 전송, 다음 준비 커버 슬립에 아가로 오스 중 하나를 드롭으로 배아를 전송합니다. </li><li> 아가로 오스는 견고처럼 원하는 배아를 놓습니다. 작업이 완료되면 이미지 챔버가 커버 슬립이 상단 표면되도록 뒤집힌 것입 것을 명심하십시오. </li><li> 당신은 전동 무대를 한번에 이미지를 여러 위치에 수, 반복은 각 배아에 대한 1.4-1.6 단계를하십시오. </li><li> 아가로 오스가 완전히 응고 허용, 다음 0.02 % tricaine PTU 링거스와 함께 반지를 입력합니다. </li><li> 유리 슬라이드와 함께 반지 (들)을 커버 후, 링 (들)의 반대쪽에 진공 그리스를 적용합니다. 이상 밀봉된 챔버 (들)을 뒤집기. 이 챔버는 직립하거나 거꾸로 현미경에서 이미지 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2 부 : 카멜레온 티 - 사파이어 레이저로 맞춤 내장된 두 광자 현미경을 사용하여 두 광자의 axotomy <ol><li> 이미지 준비. 현미경 슬라이드 홀더에 장착 배아 (들)을 놓으십시오. 40X (NA 0.8) 물 객관적인 하나의 배아에 중점을두고 있습니다. 레이저를 켭니다. 우리는 reproducibly 시각화 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 뉴런을 표현하는 GFP를 손상 수있다. 비 피해 전력 axons을 시각화하기 위해 910 나노미터의 파장 (NM)와 30 전력 (MW가 나와있는 예제에서 권력의 금액) 밀리 와트로 레이저를 설정합니다. 이미징 소프트웨어를 엽니다. 우리는 카렐 스보보다의 연구실 2, 3에서 개발된 ScanImage 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 두 광자 레이저로 배아를 검색하도록 초점을 누르면, 당신이 axotomize하고자하는 축삭을 찾아,이 축삭의 이미지를 캡처합니다. 처음이자 마지막 Z 위치를 마크 이미지를 획득하고, Z 스택의 최대 투영합니다. </li><li> 당신이 스캔을 axotomize 및 중지하고자하는 축삭의 가지에 70X 확대. 180 MW의 손상 전원 샘플에서 MW를 증가하고, 레이저로 단일 스캔을 수행합니다. 우리는 1 Z의 조각의 개수를 설정하고 &quot;잡아&quot;를 눌러이 작업을 수행. 이것은 축삭을 도려 충분해야합니다. 당신의 현미경과 실험적인 목표에 대해이 절차를 최적화하는 방법에 대한 논의를 참조하십시오. </li><li> , 축소 30 MW로 전력을 줄이고 이미지를 가져가라. </li></ol> 파트 3 : 자이스 혈구에서 두 광자 axotomy 510 공촛점 / 두 광자 현미경 <ol><li> 장소는 무대에 배아를 탑재하고 25X 물이 목적 또는 기타 적합한 목표를 사용하여 초점에 그것을 가지고. </li><li> 그것은 하나에서 다른로 전환 가능 있도록 두 개의 광자 (9​​10 NM)와 아르곤 (488 NM) 멀티 - 트랙 설정에서 레이저를 켜십시오. 두 레이저가 GFP를 검색하는 데 사용되지만, 두 광자 방출 빨간색과 시각이며, 녹색과 아르곤 레이저 방출이 두 가지를 구별합니다. </li><li> 다치게하는 축삭을 확인하기 위해 아르곤 레이저를 사용합니다. Z 아래 설정은 처음이자 마지막 광학 섹션을 표시합니다. 공촛점 이미지를 가지고 Z 스택의 최대 투영을 만듭니다. </li><li> 부상으로 축삭의 지역을 선택과 집중에이 지역을 가​​지고. 아르곤 레이저를 끄고 두 광자 레이저를 켜십시오. 축삭 초점 아직 있는지 ~ 9 %의 전송의 레이저 강도에서 두 광자로 표본을 검사합니다. </li><li> 자르기 도구를 사용할 수 있도록 &quot;중지&quot;버튼을 클릭하십시오. 관심의 영역을 확대하기 위해 작물을 사용합니다. 보통 우리는 ~ 70X (확대가 &quot;모드&quot;탭에서 확인할 수 있습니다)로 확대할 수 있습니다. &quot;채널&quot;탭 아래 15~20%의 전송 ~ 9 %의 전송에서 두 광자의 강도를 변경합니다. </li><li> 축삭을 도려하면 여분의 손상을 방지하려면 정지 버튼을 누르면 약 1 초 후과에 대해 &quot;빠른 XY&quot;버튼을 활성화합니다. 프로 시저가 작동하는 경우 축삭은 흩어져 파편으로 간주되어야합니다. </li><li> 보장하기 위해 그 축삭488 nm의 아르곤 레이저로 다시 전환 손상되었다, 다른 공촛점 이미지를 가지고, 최대 프로젝션을 만듭니다. </li></ol> 4 부 : 자이스 혈구 LSM 510에 공촛점 시간 저속 영상 <ol><li> 이미지 준비. 당신은 열띤 무대를 사용하는 경우, 시간 경과 영화를 설정하기 전에 최소한 30 분 거리에 그것을 설정해야합니다. 현미경 슬라이드 홀더에 장착 배아 (들)을 놓으십시오. 원하는 공기 목적 하나의 배아에 중점을두고 있습니다. 우리는 20X, 0.5 NA 목표를 사용합니다. 오픈 자이스 혈구 LSM 510 이미징 소프트웨어. 적절한 레이저의 전원을 켜고 원하는 구성을 설정합니다. 우리는 지금 자이스 혈구 LSM 멀티 타임 소프트웨어와 함께 장기적인 이미지에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 방법은 이미징 소프트웨어를 자신의 현미경에 사용하기 위해 적용할 수 있습니다. </li><li> 멀티 타임 윈도우에서 처음으로 배아의 위치 및 구성을 정의합니다. 스캔, 무대, 그리고 멀티 시간 창을 엽니다. 빠른 검색 창에서 검색을 활성화합니다. 원하는 XY 위치로 무대를 이동합니다. 스캔 윈도우에서 처음이자 마지막 Z 위치를 표시합니다. 또한, 검색 창에서, 다음 중순 중지를 누르십시오. 완료 중간 Z 슬라이스의 스캔을 위해 잠깐, 다음 단계 창의 마크 위치를 누르십시오. 하나의 배아만을 이미징하는 경우, 다중 시간 창에서 &quot;단일 위치 &#39;탭을 클릭하십시오. &quot;교체 XYZ&quot;을 클릭 후 &quot;구성 저장&quot;. 이전 구성을 덮어쓸 것인지 물었을 때 동의합니다. 4.4 단계로 진행합니다. 당신이 기계 무대를 갖고있다면, 이미지 여러 배아 여러 위치를 설정할 수 있습니다. 이 경우, 당신은 첫 번째 위치를 XYZ 및 구성을 정의하기 전에 &quot;여러 위치 &#39;탭을 선택합니다. 또한, &quot;여러 위치 &#39;탭 아래의 풀다운 메뉴가 위치 1되었는지가, 그리고가 설정 저장을 클릭하기 전에 구성 섹션의 풀다운 메뉴, LOC 1 멀티 말하고. </li><li> 멀티 시간 윈도우에 남아있는 태아의 위치 및 구성을 정의합니다. 다음 배아를 찾은 후, 빠른 스캔을 눌러 원하는 위치에 XY 스테이지를 이동하고, 검사 창에서 처음이자 마지막 Z 위치를 표시합니다. 또한, 검색 창에서, 다음 중순 중지를 누르십시오. 완료 중간 Z 슬라이스의 스캔을 위해 잠깐, 다음 단계 창의 마크 위치를 누르십시오. &quot;교체 XYZ &#39;을 클릭하십시오. &quot;구성 저장&quot;을 누른 다음 구성 섹션의 풀다운 메뉴가 멀티 LOC이 말하는 것은 그저 &#39;여러 위치&#39;탭 아래의 풀다운 메뉴가 위치 2 있는지 확인합니다. 이전 구성을 덮어쓸 것인지 물었을 때 동의합니다. 남은 배아에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 다중은 Loc 윈도우에서 이미지 수집을위한 매개 변수를 설정합니다. &quot;블록의 목록&quot;섹션에서 GR - GL 옵션을 선택한 다음, 그룹 반복의 원하는 번호를 입력합니다. 이것은 공촛점 각 위치에서 이미지를 획득됩니다 횟수입니다. 매개 변수 섹션에서 원하는 대기 간격을 입력합니다. 이것은 하나의 영상 반복의 시작에서 다음 반복의 시작 시간의 금액입니다. 구성 섹션의 &quot;ZStackXY&quot;를 선택하십시오. 당신에게 아래 섹션에서 기본 파일 이름을 입력합니다. &quot;을 선택 이미지 DB&quot;를 클릭하여 MDB를 선택하십시오. &#39;옵션&#39;버튼을 클릭하십시오. 임시 파일을 저장하여 MDB 폴더를 선택합니다. &quot;최종 이미지를 저장&quot;및 &quot;Z 스택의 중간&quot;, &quot;최종 이미지가 뜨고 &#39;확인하십시오. 간격을 기다 선택합니다. 옵션 창을 닫습니다. &quot;시작 시간&quot;을 클릭합니다. 이미지의 기간 동안 멀티 시간 창문을 열어 둡니다. </li><li> 데이터를 분석할 수 있습니다. 시간 경과 이미징가 완료되면, 멀티 시간 소프트웨어는 임시 파일의 각 위치에 대한 요약 파일에 모두 컴파일됩니다. 당신이 완료되기 전에 동영상을 막으려면 요약 파일이 생성됩니다 그래서, &quot;그만하세요&quot;대신 &quot;Finish&quot;를 누르십시오. 임시 파일 및 요약 파일은 자동으로 지정 MDB 폴더에 저장해야합니다. LSM 소프트웨어 메뉴에서 &quot;프로젝션&quot;다음 &quot;3D보기&quot;를 클릭하십시오. 풀다운 메뉴에서 선택한 요약 파일과 함께, &quot;적용&quot;을 클릭하십시오. 이것은 각각의 공촛점 이미지의 Z 스택의 최대 추정치를 생성합니다. LSM 소프트웨어 메뉴에서 &#39;내보내기&#39;, &#39;파일&#39;을 클릭하십시오. TIF 파일의 일련의 최대 예상을 저장합니다. 그런 다음 ImageJ 또는 QuickTime Pro를 사용 TIF 파일의 일련의 밖으로 영화를 만들 수 있습니다. LSM 이미지에 Axons은 축삭의 형태에 대한 자세한 양적 정보를 생성하는 이미지 분석 소프트웨어 (MicroBrightfield에서 예 NeuroLucida)를 사용하여 3 차원에 추적할 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 성공적인 실험은 세포 역동의 정확한 표현 발생합니다부상에서 축삭 복구의 S. 당신의 배아가 눈에 띄는 변성과 강한 심장 박동과 함께, 영상 후 건강한 것입니다. axotomy은 축삭의 정의 지점 severing, 정확한 손상을해야합니다. 주변 axons와 최소한의 세포 죽음에 아무런 부상이 없어야합니다. 우리는 직접 실험 ~ 50 % axotomy의 사이트에 단일 표피 세포의 죽음을 볼 수 믿습니다. 더 많은 손상을 관찰하면 토론에 설명한 바와 같이, 당신은 두 광자 프로토콜을 최적화해야합니다.

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	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

우리는 정확하게 주변 감각 axons을 axotomize하고 직접 생활 zebrafish 배아에서 재생을 관찰하는 설명 방법을 사용했습니다. zebrafish에서 장기 시간이 경과 공촛점 영상은 생체내 많은 발달 과정을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 설명한 두 광자 axotomy 절차는 여러 실험 목표 수정할 수 있습니다. 우리는 휴대폰 본체보다는 주변 축삭의 가지에 확대하여 전체 삼차 신경 감각 세포의 시체를 ablate...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish는 오래 살아있는 투명한 배의 시간이 경과 이미징에 의해 개발의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하기 위해 이용되었다. 여기 우리는 장기 이미징을위한 zebrafish의 배아를 탑재하고 공촛점 현미경을 사용하여 시간 경과 이미지 캡처를 자동화하는 방법을 보여주는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 두 개의 광자 현미경에 장착된 femtosecond 레이저의 초점을 맞춘 전력을 사용하여 zebrafish에 주변 감각 axons의 개별 지점 관리, 정확한 손상을 만드는 방법을 설명합니다. 성공적인 두 광자 axotomy 대한 매개 변수는 각 현미경에 최적화된해야합니다. 두 가지 예제를 제공하기 위해 사용자 정의 내장된 두 개의 광자 현미경 및 자이스 혈구 510 공촛점 / 두 광자 모두 두 광자 axotomy을 설명합니다. Zebrafish 삼차 감각 뉴런은 감각 뉴런 특정 발기인 1 구동 유전자 변형 라인 표현 GFP에 시각하실 수 있습니다. 우리는 직접 zebrafish 배아 생활 감각 축삭 재생을 관찰하기 위해이 zebrafish 삼차 모델을 적응있다. 배아는 tricaine와 anesthetized하고 그것이 굳은로 아가로 오스의 드롭 내에 위치. 고정 배아는 phenylthiourea (PTU) 링거스 가득 이미징 챔버 내에 봉인하고 있습니다. 우리는 배아가 지속적으로 12~48시간 이러한 실에서 몇 군데 수있는 것으로 나타났습니다. 하나 공촛점 이미지 다음 axotomy의 원하는 사이트를 결정하기 위해 캡처합니다. 관심 지역은 이미징 낮은 비 피해 전원에서 감각 axons하여 두 광자 현미경에 위치하고 있습니다. axotomy의 원하는 위치에 확대 후, 전원이 증가하고 정의된 지역의 한 검사는 축삭을 끊을 수있는 충분한입니다. 여러 장소 시간 저속 영상 그러면 바로 부상에서 axonal 회복을 관찰할 수 공촛점 현미경에 설정됩니다.

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K 조회수.  University of California, Los Angeles. 여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

비디오: Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

연구

생물학

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em&gt; C. elegans</em&gt; 태아

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...