서던 애리조나 베테랑 어페어스 건강 시스템 VA 메리트 부여 검토 0142 및 아리조나 바이오 메디컬 연구위원회 부여 0803에서 제공하는 자금.

조직이 슬라이드에서 볼 수 준비 <ol><li> colonoscope는 항문을 통해 대장으로 전달이 가능합니다. colonoscope은 조명과 머리에 비디오 카메라를 가지고 긴 튜브이고, 능력은 콜론보다 시각화 수 있도록 긴 풍선처럼 날려 버릴 결장에 공기를 통과하고, 수 생검 포셉을위한 통로를 가지고하는 우리에게 생검 표본을 제공하기 위해 안쪽 표면에 &quot;스킨&quot;또는 콜론의 점막 층의 3-5mm 지역을 공략하기 위해 비디오 카메라를 넘어 확장. 생검 포셉도 잠재적으로 결장에서 발견 사전 암의 폴립을 제거하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 우리는 정보의 동의, 환자에서 정상 colonic 점막 조직의 biopsies을 획득하였습니다. 이러한 환자는 위장병 클리닉에서 심사 결장경 검사법을 겪고 있었다. 우리 biopsies는 포르말린의 항아리에 배치했다. 사시간 후, 포르말린은 70 % 알코올로 대체되었습니다. </li><li> 조직의 비슷한 샘플이 1cm와 10cm 거리에 고급 neoplasia과 결장 암 또는 adenomas에서 있었다 수술하는 동안 제거 결장 resections의 분야에서 찍은. 이 조직 샘플도 포르말린에 배치되었고, 조직 샘플이 큰라면, 일부는 70 % 알콜에 배치되기 전에 이상 기간 동안 포르말린에 보관했다. </li><li> 조직 샘플은 처리 및 파라핀 블록에 배치되는에 대한 조직학 연구소로 이동합니다. </li><li> 파라핀 블록은 그들보다 쉽게​​ 마이크로톰로 절단하기 위해 냉장고에 차게됩니다. </li><li> 4 마이크론 두께의 조직 섹션은 마이크로톰을 사용하여 조직 블록에서 절단하고, 물에 떠내려 있습니다. </li><li> 이 슬라이드의 각 세 조직이 섹션이 때까지 인스턴스 ERCC1 및 Pms2 위해 두 단백질의 표현을 비교 들어, 다른 조직 섹션은 두 개의 슬라이드로 데리러 수 있습니다. 예를 들어, 섹션 1, 3, 5 ERCC1과 섹션 2, 4, 6 Pms2 표시된 슬라이드에 삽입할 수 표시 슬라이드에 둘 수 있습니다. 세 조직 섹션은 단일 슬라이드 한 단백질에 대한 immunostained 것은 아티팩트가 슬라이드에 하나 이상의 조직 섹션에서 반복되지 않을부터 토굴의 이상한 얼룩 패턴이 유물하거나 실제인지 볼 수 있습니다. 콜른 crypts 약 15 조직 섹션 하나의 토굴을 통해자를 수, 같은 토굴가 슬라이드마다 여러 조직 섹션에서 볼 수 있도록, 직경 약 60 미크론입니다. </li></ol> 조직 섹션을 Immunostaining <ol><li> 슬라이드는 다음 immunohistochemical 분류 절차를 통해 부착 할 것입니다. 이것은 8 시간 과정이며, 매우 표준입니다. 표준 없습니다 우리가 사용하는 절차의 부품, 얼룩에 대한 Sequenza 컨테이너의 사용이며, &quot;스나이퍼&quot;라는 배경 얼룩을 줄일 수있는 솔루션 중 하나를 사용하십시오. &quot;스나이퍼&quot;솔루션은 Biocare 의료, 콩코드 CA에 의해 독점적인 공식으로 판매됩니다. </li><li> 우리의 절차의 단계 중 일부는 여기에 표시됩니다. </li><li> 예를 들어, Pms2 immunohistochemistry를 위해, 슬라이드는 95 % 에탄올 2 변화 (2 분 뒤에 100 % 에탄올 2 변화 (2 분마다), 다음 크실렌 3 변화 (3 분마다)에 배치하여 첫번째 deparaffinized 아르 각), 증류수 2 변경 (2 분마다)으로 따라갔다. 실험자이 증기에 노출되지 않도록이 절차는 부정적인 공기 압력과 화학적 후드 아래에 진행됩니다. </li><li> 처음 조직을 수정하는 데 사용되었을 때 포르말린, 조직 샘플에서 단백질의 일부​​는 교차 연결되었다. 이제 우리는 항체가 관심의 단백질을 인식할 수 있도록 상호 링크를 휴식해야합니다. 슬라이드는 전자렌지에서 물에 뛰어든다면 버퍼 솔루션에 배치됩니다. 이것은 매체 설정 10 분 뒤에이야, 빙판에 20 분 동안 냉각로 따라갔다. 이 단계는 좋은 결과를 얻을 때까지, 다른 전자 레인지에 대해 테스트하고 조정해야합니다. CcOI 또는 Ku86를 immunostaining을 위해 우리가 9mL 구연산 산성 + 41mL 나트륨 구연 산염에 대해 6.0의 산도를했다 ERCC1 위해 우리가 만든 구연 산염 버퍼를 사용하여 + 450mL H 2 O (나트륨 이온을 포함하여 버퍼)로 만든 나트륨 구연 산염 버퍼를 사용합니다 2.1g 구연산 산성과 + 1리터 H 2 O + ~ 5mL 나트륨 6.1 (최소한의 추가 나트륨 이온과 버퍼)에 산도를 가지고 수산화 및 Pms2을 위해 우리는 5mL 항원 Unmasking 솔루션 (벡터로) + 533mL로 만든 솔루션을 사용 H 2 O. 다른 버퍼는 특정 단백질과 항체 epitopes 상호 작용을 높이기 위해 필요합니다. </li><li> 슬라이드는 다음 3 분 증류수로 씻어하고, 5 분 (PBS라고도 함) 인산 버퍼 호수에 씻은 다음 20 분 3 % 과산화수소 (메탄올에 희석)에 부착 할 것입니다. </li><li> 슬라이드는 다음 Sequenza (써모 과학에서 쉔던 Sequenza의 Immunostaining 시스템)라는 평면 좁은 얼룩 랙에에 배치하고 PBS로 씻어서 있습니다. </li><li> ERCC1 또는 Pms2에 대한 immunostained되는 슬라이드 그런 다음 10 분에 노출되는배경 단백질이 아닌 구체적인 얼룩을 줄이는 행위 &#39;스나이퍼&#39;라는 Biocare에서 얻은 독점적인 솔루션, 3 방울의 추가 치료에 노출 백인 군대가. </li><li> 슬라이드는 1 ML 트윈 + 100 ML 10X 트리스 + 900 ML 증류수입니다 [10X 트리스는 24.2 g Trizma + 80g NaCl + 1,000 ML 증류수 및 탈이온수 + 집중 HCL (어디에 버퍼 &quot;TBST&quot;로 씻어서 아르 약 15 ML)는 산도 7.6]에 대한 해결책을 가지고 있습니다. </li><li> 슬라이드가 다음 버퍼로 세 번 씻어서하고, DAKO 100 microliters은 1:100 희석 (버퍼 TBST에서 만든 2퍼센트 소 혈청 알부민의)에서 이차 항체를 biotinylated 아르 것은 슬라이드에 추가하고 실온에서 30 분 incubated입니다. </li><li> 이 시점에서, Vectastain ABC (아비딘 비오틴 복합) (벡터 연구소에서) 시약은 2.5 ML PBS, 1 드롭 솔루션, 1 드롭 솔루션 B를 사용하여 준비하고, 솔루션은 30 분 동안 서 허용됩니다. </li><li> 슬라이드는 TBST 버퍼와 3 번 씻어서 있습니다. </li><li> 다음 Vectastain ABC 시약 3 방울 추가되고 슬라이드가 TBST로 2 번 rinsing 다음, 30 분 동안 상온에서 incubated입니다. </li><li> 슬라이드는 다음 약 5 분 DAB (diamino - benzamide) (2.9 ML DAB + 400 microliters PBS + 250 microliters의 과산화수소)에 열중하고 있습니다. </li><li> 슬라이드는 다음 증류수, 탈이온수 2 번 씻어서 있습니다. </li><li> Counterstaining 10 초 동안 hematoxylin의 희석 용액과 함께 이루어집니다. 슬라이드는 탈이온수 다음 수돗물로 깨끗이 씻어서 있습니다. </li><li> 슬라이드 다음 95 % 에탄올에 2 분, 100 % 에탄올 2 분 크실렌 2 분 2 회 2 번 탈수 2 배입니다. </li><li> Cytoseal XYL (리차드 - 앨런 과학)의 방울의 몇 가지는 다음 슬라이드에 추가하고 coverslip이 적용됩니다. </li><li> ERCC1, Ku86과 CcOI의 Immunohistochemical 평가 Pms2과 동일한 프로토콜을 사용하여 수행하지만, ERCC1, Ku86과 CcOI에 대한 항체로 Pms2 항체를 교체 아래 표에 설명되어 있습니다. </li></ol> ERCC1 표현에 결함 crypts, Pms2, Ku86과 CcOI에 대한 조직 섹션을 평가 <ol><li> 우리는 colonic 점막의 crypts에 Pms2과 ERCC1의 표현 Motic (DM - BA300) photomicroscope에 따라 조직 섹션에서 최초 것입니다. </li><li> Pms2과 ERCC1 모두 DNA 수리 효소 있으며, DNA가 어디 그래서 그들은 crypts의 세포의 핵에 위치하고 있습니다. 이것은 ERCC1에 대한 얼룩을 대표하는 브라운 콜론, 토굴에서 세포의 핵에서 발생 그림 1에 표시됩니다. 우리가 현미경에 처음 표시 일반 토굴은 ERCC1에 대한 스테인드, 그리고 갈색 얼룩이 ERCC1의 위치를​​ 보여줍니다되었다. 우리는, &quot;고블렛 세포&quot;가 지하실의 바깥에있는 세포의 바닥에 작은 지역에서 핵으로 다소 와인 유리 모양의 crypts, 그리고 ballooning 섹션 밖에서 세포의 유형을 지적 지하실 안쪽에있는 세포의 부분에 흰색 mucin의 과립으로 가득. 세포의 다른 두 종류의 스테인드 섹션에 비슷하게 다소 보면, 그들은 enterocytes 및 enteroendocrine 세포이며, 그 핵은 세포의 기본에, 지하실의 바깥쪽 가장자리도 있습니다. 여기에 같이 colonic neoplasia 없었 환자, 또는 멀리 결장암의 사이트에서 biopsies에서 찍은 biopsies에서 거의 모든 모든 crypts의 핵 중 ERCC1 표현의 정상적인 높은 수준을 보여줍니다. </li><li> 동양없이 colonic neoplasia 환자의 biopsies에서 얻은 우리의 관찰, 조직 섹션 정상 colonic 점막에 Pms2 표현의 수준 ERCC1, CcOI 또는 Ku86에 대해 관찰하고 있습니다. 우리가 천천히 crypts, 간질성 세포, 슬라이드의 모든 림프 nodules, 그리고 muscularis 밖으로 전체 조직 섹션 및 지점 통과로 우리는 (40x 목적 렌즈와 정상 조직 섹션에있는 모든 crypts을 볼 수있는 경우 생검에서). </li><li> 우리는 또한 줄기 세포의 지하실 바닥에 단지 몇 가지 세포가있다는 것을 지적. 이러한 줄기 세포는 전체 지하실의 약 2,000 세포를 모두 생성합니다. 돌연변이 또는 epimutation있는 줄기 세포는 전체 줄기 세포 틈새 이상 걸릴 수 있습니다. 그런 다음 전체 토굴 우리가 CcOI 높은 표현을 crypts 옆에 CcOI에 대한 결함 전체 crypts를 참조하십시오 어디서 우리가이 새 슬라이드보기로 관심 효소 (토굴 변환)에 대한 얼룩 변경될 수 있습니다. </li><li> 그렇다면 우리는 결장암 또는 고급 neoplasia과 adenoma있는 환자에서 슬라이드를 표시합니다. 이 슬라이드에 일부 crypts은 ERCC1에 대한 표현의 정상적인 높은 수준을 가지고 있으며 일부는 표현의 낮은 수준을했습니다. 조직 섹션 내에서 crypts 모든 10X 목적 렌즈와 낮은 해상도로 촬영하고, 전체 조직 섹션 하나의 이미지에서 볼 수 있습니다 있도록 이미지 타일입니다. crypts 그런 다음 번호가 있습니다. </li><li> 멀리 서있는 biopsies에서 crypts 전형적인 효소의 높은 표정으로 crypts,m 모든 암은 레벨 &quot;4&quot;얼룩이라고합니다. 감지 아무런 표현이없는 경우 살짝만 감지 표현이 분명있다면 다른 수준, &quot;1&quot;을 &quot;0&quot;입니다, &quot;2&quot;는 표현이 선물이있다면,하지만 훨씬 낮은 수준 4보다 수준 및 &quot;3&quot;의 표현이있다면 4보다 낮은 수준에서 존재하지만, 상당히 강한. 우리는 2 노란색, 3 녹색 주황색 1과 0에 대한 적색, 4에 대한 낮은 해상도 이미지 파랑의 각 슬라이드를 점. 여기 40x 목적 렌즈를 사용하여 조직 검사에서 섹션을 통해가는 보여줍니다. 우리는 낮은 해상도 이미지에 crypts을 점. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 지하실 세포의 핵에서 ERCC1 높은 표현을 보여주는 colonic 토굴. 이 이미지의 모든 색상은 동일 페인트 샵 프로 5를 사용하고, 명암과 채도의 향상되었다. 대표 결과 <ol><li> 별도의 슬라이드에 다른 조직 섹션은 우리가 immunohistochemistry으로 표시된 두 개의 서로 다른 단백질의 표정으로, 동일한 colonic crypts 볼 수 있습니다. ERCC1 한 Pms2에 대한 토굴 자국과 같은 토굴 자국의 이미지가 인접한 컴퓨터 모니터 옆에 현미경에 표시됩니다. 이것은 우리가 공동 결핍은 각 자주있는 동안, 독립적으로 발생하는 두 단백질 또는 단백질의 각 결함 여부가 있는지 확인할 수 있습니다. 우리는 단백질의 표현에 명백한 결핍이 유물로 인해 하나 이상의 섹션에 결함되고, 그리고으로 확인할 수 있도록 슬라이드 지당 3 조직 섹션이 있습니다. 암에 상승을주는 현장 결함이 결장 암을 주변 조직에서 ERCC1 및 Pms2에 대한 결함 crypts의 고주파가 있습니다. </li><li> 우리는 또한 Ku86과 CcOI에 대한 결함 crypts의 빈도를 찾을 수 immunohistochemistry를 사용했습니다. 이 슬라이드에, 우리는 전체 조직 섹션 40x 목적 렌즈를 사용하여, Ku86에 대한 immunostained 통과하고, 우리는 몇 가지 crypts이 조직 섹션에서 Ku86에 대한 결함이있다는 것을 알 수 있습니다. </li><li> 마찬가지로,이 슬라이드에, 우리는 전체 조직 섹션 40x 목적 렌즈를 사용 CcOI에 대한 immunostained 통과, 우리는 crypts만을 적당한 숫자가 CcOI에 대한 결함이있다는 것을 알 수 있습니다. </li></ol>

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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+induced+by+reactive+oxygen+species+in+hepatocellular+carcinoma:+methylation+of+the+E-cadherin+promoter.">Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter.</a> Gastroenterology. 135, 2128-2140 (2008).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+as+carcinogens+in+human+gastrointestinal+cancers.">Bile acids as carcinogens in human gastrointestinal cancers.</a> Mutat Res. 589, 47-65 (2005).</li><li>Payne, C. 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<ol><li> 그것은 슬라이드 당 3 조직 섹션을 가지고 매우 중요합니다. 항체를 가지고있는 미디어를 적용할 때 거품은 거품이 조직 섹션 반응에서 항체를 방해 때문에 crypts의 일부 crypts 또는 일부가 적절하게 얼룩되지 않을 수 있도록 발생할 수 있습니다. Crypts 직경이 60 마이크론이며, 조직 섹션 4 미크론 두께되므로, 같은 토굴을 통해 많은 15 조직 섹션이있을 수 있습니다. 그것은 슬라이드에 배치 여러 조직 섹션에서 가이드로 토굴의 형태를 사용하여 같은 토굴을 찾을 일반적으로 수 있습니다. </li><li> 최근 연구에서, 큰 조직 샘플, Sequenza에 얼룩하면 조직에 좋은 항체 범위를 제공하지 않을 수 있습니다. 이러한 경우에는, 하나는 항체를 포함하는 미디어의 드롭 각 조직 샘플을 통해 직접 배치하는 조직의 손 얼룩을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 위해 명확하게 immunostained 단백질, 그리고 컴퓨터 모니터에 핵 DNA를 보여주는 파란 얼룩의 표현을 보여주는 갈색 얼룩을 참조 Motic photomicroscope 소프트웨어가 다음과 같이 조정됩니다 게인 0, 0 오프셋, 감마 1.00, 0, 0, 255 강화 선명도 1, 색상 보정 7, R, G, B 게인 1.00, 그리고 R, G, B의 밝기 0. 해상도는 1024 X 768에 설정하고, 화이트 밸런스를 사용할 수 있습니다. </li><li> 우리의 방법은 어떤 단백질이 결장암에 진행에 중요하다고 생각 결핍증 자신의 주파수를 평가하기 위해 사용, 또는 가능성 overexpression, 고급 neoplasia과 결장의 암 또는 adenomas을 둘러싼 현장 결함 인치 수 </li><li> 필드 결함 암에 진행의 부분입니다 기간 &quot;필드 cancerization는&quot;처음 슬로터 외 의해 사용되었다. 1953 1 않도록 암의 개발 방향을 predispose에 크게 알려지지 않은 프로세스 (당시)에 의해 preconditioned되었습니다 상피의 면적 또는 &quot;필드를&quot;설명합니다. 초기 사용은 구강 암의 맥락에서했다. 이후 용어 &quot;필드 cancerization&quot;와 &quot;현장 결함은&quot;새로운 암 발생 가능성이 더 높습니다 어느 미리 악성 조직을 설명하는 데 더 널리 사용되고 있고, 임상 종양학의 필드 cancerization의 개념은 증가주의에게 2 받았습니다 . 우리는 최근에 위장 암 3 필드 결함에 대한 증거를 검토. 콜론 필드에 결함의 증거를 제공하는 다스 연구의 결과는 있었다이 리뷰에 포함. colonic 점막의 필드 결함은 아마도 한 줄기 세포는 틈새 계승의 4 남아 그러한 토굴의 줄기 세포 중에서 돌연변이 세포 또는 epigenetically 변경 세포의 자연 선택에 의해 발생. 유전 불안정하거나 DNA 뉴클레오 티드 절단 수리 또는 DNA 불일치 복구의 감소로 인해 아마도 mutator의 표현형는,이 프로세스를 가속 것입니다 (그리고 Pms2에 자주 결함는 이전에 다음 ID로 결장 암 5 주변 지역에서보고되었다.) colonic 점막에있는 줄기 세포의 정상적인 인구, 세포가 돌연변이 또는 epimutation 통해 선택적 이점을 확보,면, 그것은 이웃 줄기 세포의 비용으로 clonally 확장하는 경향이 있습니다. colonic 점막에서 줄기 세포 틈새는 다음 모든 (약 2000)에 토굴의 세포를 야기할 ≤ 5 세포 6 차지하고있다. &quot;토굴 변환&quot;7 돌연변이 또는 epigenetically 변경 셀 유형 결과에 의해 줄기 세포 틈새의 - 인수. colonic 상피에서 변이된 클론의 확산 (변환 crypts)은 가장 자주 토굴 분열 8 시까지 발생할 수 있습니다. 토굴 핵분열의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이러한 방법으로 비정상적인 조직의 패치가 발생합니다. 이러한 패치 내에서 두 번째 이러한 돌연변 이는 주어진 토굴이 패치 내의 다른 crypts에 비해 우위를 획득하고,이 지하실은 원래의 패치 내에서 clonally 보조 패치를 형성 확장 수 있도록 발생할 수 있습니다. 악성 줄기 세포 clonally 암으로 확장하는 발생하기 전까지이 새로운 패치 내에서 프로세스는, 아마도 수십 년 동안, 몇 시간을 더 반복될 수 있습니다. 이 산발적 colonic adenocarcinomas가 발생하는 일반적인 과정이라면, colonic adenocarcinomas 일반적와 관련된되어야하고, 이상의 필드 앞에 있습니다. 따라서 변환 crypts의 패치는 고급 neoplasia과 adenoma을 둘러싼, 또는 결장암을 둘러싸고있는 영역에서 감지 결함을 가지고 기대 수도 있습니다. 사전 종양 진행이 모델에서, 하나는 암으로 진행 가능성이있는 결장의 종양 병변을 주변 지역에 비 종양 colonic 점막에서 가져온 조직 샘플 간의 사전 종양 진행에 관련된 유전자 또는 epigenetic 변경을 찾을 수있을 것 같은데요 . 특히, DNA 복구 효소에서, 또는 apoptosis에 필요한 단백질에 결함이 게놈 불안정성을 강화하여 진행에 기여할 것이며, 결함이있는 현장에서 발견된 것으로 기대 수도 있습니다. </li><li> 세포 D 아르 Pms2의 결핍에 대한 선택ERCC1에 대한 eficient 및 DNA 손상 에이전트 대상이 나라 외가 9. 중국 햄스터 난소 세포의 25 문화 43 - 3B, DNA 복구 유전자 ERCC1의 운영을 중지시키지 돌연변이로 모두를 성장하고, DNA를 손상 요원과 함께 문화를 처리, MNNG. DNA 손상의 치료를 생존 세포 중 하나의 세포는 각 문화에서 격리와 복제를 형성하기 위해 허용되었다. 격리된 모든 클론은 부모의 부담보다 MNNG에 의해 살인을 약 10 배 이상 저항했다. 격리된 클론, 22 DNA 불일치 복구 (MMR)에 결함이 입증되었다. 이러한 22 클론 중 5 시퀀싱에 의해 테스트 및 다섯의 세 Pms2에 대한 결함 하였다. Pms2의 결함에 대한이 선택 Pms2 결핍증은 apoptosis에 대한 저항력을 발생하기 때문에 아마도 있었고, ERCC1가 결석했을 때 세포에 남아있는 추가 DNA 손상을 생존하는 것이 능력. (일반적으로 Pms2 감각의 DNA 손상 수준, 그리고 DNA 손상이 과도하면 apoptosis를 받아야하는 세포를 일으 킵니다.) 그러므로, Pms2의 결핍은 ERCC1 - 결함 세포가 DNA 손상의 대상이 경우에 대한 선택됩니다. 부모의 세포보다 자외선과 조사 때 ERCC1과 Pms2 모두 결함이 클론은 500-1000 배 이상 돌연변이 비율에 관한에게 표시했다. </li><li> 담즙의 분비는 산화 스트레스의 원인이 DNA 손상 대리인이며, 결장암에 진행에 중요한 Deoxycholic 산, 담즙산은 mitochondria 10 손상을 포함하여 여러 프로세스에 의해 반응 산소 종 (ROS)의 생성을 통해 산화 스트레스를 증가시킵니다. ROS가 epigenetic 변화 11 원인, 그리고 최소한 15 연구 담즙 분비가 높은 지방 음식을 동반 증가 농도에서 DNA 손상 12 원인 것으로 나타났습 것을 최근에 증거가있다. 마찬가지로 번스타인 외 검토. 12,식이 지방 소비 결장암의 발생률 사이에 긍정적인 연관이 있습니다. 담즙 분비가 다이어트에 지방에 대한 응답으로 창자로 분비하고, 담즙 지방산은 세제가 지방의 소화에 도움을 역할을하고 있습니다. 따라서, 높은 지방 음식은 증가 담즙산의 분비와 연결되어 있습니다. 방패 담즙산의 농도는 결장암의 높은 발병률과 인구에 상승하고 있으며, 담즙 분비에 과도한 노출 13 carcinogenesis 콜론에 대한 주요 위험 요인으로 간주됩니다. 담즙 분비가 결장에있는 필드 결함의 원인이 될 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 3. crypts에 colonic 토굴의 fissioning. 결론 우리는 결장 암을 둘러싼 넓은 필드 결함의 DNA 복구 유전자 ERCC1 및 Pms2 (Pms2 또한 apoptosis가 필요합니다)에 결함 crypts의 높은 주파수를 발견했습니다. ERCC1 및 Pms2 (epigenetic 변화 또는 돌연변이에 의한)에 결함이 결장암으로 진행하기 위해 중앙 유전 불안정성 초기 단계가 될 수 있습니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PMS2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ERCC1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>MS-671-P1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ku86 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotech.</td>
<td>SC-9034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CcO1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>459600</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated secondary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAKO</td>
<td>E0413</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22% BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Informagen, Inc.</td>
<td>2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sniper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocare Medical</td>
<td>BS966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectastain ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>34001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>20605</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal XYL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48212-196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer

carcinogenesis에서 &quot;필드 결함&quot;이 때문에 종종 가까운 위치에 동일한 조직 유형의 다른 malignancies을 개발하는 특정 암의 생존자의 높은 성향의 임상 인식됩니다. 이러한 필드 결함은 결장암에 표시하고 있습니다. 콜론의 현장 결함에 대한 책임은 분자 이상은 colonic 선암을 둘러싼 또는 고급 neoplasia (물론, 결장암으로가는)와 adenoma를 둘러싼 histologically 정상 조직에 고주파에서 감지 있어야하지만 낮은 주파수에서 colonic neoplasia없이 환자에서 colonic 점막 인치 immunohistochemistry를 사용하여, colonic adenocarcinomas 또는 고급 colonic neoplasias의 각 측면에 10cm 이내에 전체 crypts 두 DNA 수리 단백질, Pms2 및 / 또는 ERCC1에 자주 감소 또는 표현에 결석 것으로 판명되었다. Pms2는 물론 초과 DNA 손상과 세포의 apoptosis에 필요한 DNA 불일치 복구에 적극적으로 이중 역할 단백질입니다. ERCC1은 DNA 염기 절단 수리에 활성화됩니다. ERCC1와 Pms2 모두의 감소 또는 부재 표현은 생존을 증가 능력 (apoptosis 저항)와 mutability의 증가 수준을 모두 세포를 만드는 것입니다. ERCC1와 Pms2 모두의 감소 또는 부재 표현 가능성이 결장암에 진행의 초기 단계입니다. DNA 복구 유전자 Ku86 (DNA에 적극적으로 참여하지 않은 동종 엔드) 및 시토크롬 C 산화 효소의 Subunit 내가 (apoptosis에 관여) 각 결장 암에 가까운 점막 영역에서 표현의 감소가보고했다. 그러나, 표현의 그들의 수준 immunohistochemical 평가 결장암 환자를 둘러싼 또는 고급 colonic neoplasia을 둘러싼 현장 결함 그들의 표현에 결함 수 crypts의 겸손한 주파수에만 낮은 보여주었다. 우리는 여기서, 표시, ERCC1, Pms2, Ku86과 CcOI의 표현 crypts 평가 우리의 방법입니다. 의 주파수가 Ku86의 결함 crypts 동안 crypts의 2 %와 주파수의 평균 가치가있다, 우리는 Pms2에 대한 결함 전체 crypts의 빈도를 표시하고 ERCC1은 종종 70 % 20cm colonic neoplasia을 둘러싼 긴 영역에서 95%처럼 위대 CcOI에 결함이 분야에서 16 %의 평균 값을 갖습니다. 전체 콜론 길이 150cm입니다 (5 피트)와 점막 층의 만 10 crypts 있습니다. 결장암을 둘러싼 Pms2과 ERCC1의 결함 따라서 1,000,000 crypts를 포함할 수 있습니다. 그것은 결장암 환자가 발생하는 결함이 토굴에서입니다.

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Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Pms2 및 / 또는 전체 crypts에서 ERCC1의 감소 / 결석 표현 가능성 colonic adenocarcinomas, 높은 mutability 암하는 모습으로 현장 결함의 기초의 각 측면에 10cm 이내에 자주 이벤트입니다. Ku86 또는 CcOI의 결핍증은 훨씬 덜 자주 이러한 필드 결함에 있습니다.

결함 Pms2, ERCC1, Ku86, 결장암을 진행하는 동안 필드 결함에 CcOI

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

deficient-pms2-ercc1-ku86-ccoi-field-defects-during-progression-to

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K 조회수.  University of Arizona, Tucson. Pms2 및 / 또는 전체 crypts에서 ERCC1의 감소 / 결석 표현 가능성 colonic adenocarcinomas, 높은 mutability 암하는 모습으로 현장 결함의 기초의 각 측면에 10cm 이내에 자주 이벤트입니다. Ku86 또는 CcOI의 결핍증은 훨씬 덜 자주 이러한 필드 결함에 있습니다.

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Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

Ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 Mesenchymal 줄기 세포로 표시

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

연구

생물학

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

운동하는 동안 에너지 시스템의 공헌을 결정

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Zebrafish의 유충의 근육 기능을 평가하기 위해 수축하는 동안 힘 측정

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

동기화를 필요로하지 않고 유동 세포 계측법을 사용하여 세포주기 진행의 시간적 추적

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

Murine 콜린 불충분 한, Ethionine 보충 (CDE) 다이어트 만성 간 상해의 모델

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction defects can be assessed by tracking methylene blue dye flow within the urinary system. Methylene blue dye is injected into the renal pelvis of perinatal embryonic kidneys and dye flow is monitored from the renal pelvis of the kidney through the ureter and into the bladder lumen after applying hydrostatic pressure. Dye accumulation will be evident in the bladder lumen of the normal perinatal urinary tract, but will be constrained between the renal pelvis and the end point of an abnormal ureter, if urinary tract obstructions occur. This method facilitates the confirmation of urinary tract junction obstructions and visualization of hydronephrosis and hydroureter. This manuscript describes a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis to confirm urinary tract junction obstructions.

Methylene blue dye injection into the renal pelvis facilitates the assessment of urinary tract junction obstruction defects during mouse embryonic urinary tract development. Here, a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis is described.

Methylene 청색 색소를 주입 하 여 요로 분기점 방해 결함 평가

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...