이러한 새로운 스페로이드 배양 방법은 암 줄기세포의 상이한 집단의 존재를 분석하기 위해 종양유발성을 연구하는 데 사용될 수 있으며, 또한 신약에 대한 높은 퍼팅 스크린을 통해 잘 적용될 수 있다. 이것은 균일하게 크기의 스페로이드의 많은 수를 생성하기위한 강력하고 반복배양 시스템입니다. 더욱이, 이 스페로이드는 암 줄기 세포를 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 방법은 만성 암 생물학을 연구하기 위하여 설치됩니다 그러나 3D 배양 조건을 변경하여 그밖 암을 공부하기 위하여 쉽게 설치될 수 있습니다. 스페로이드 형성 중에 접시를 너무 많이 움직이지 말고 스페로이드를 스트레이너로 수확할 때주의하십시오. 잘 당 안티 준수 헹구는 용액의 500 마이크로 리터와 24 웰 플레이트의 우물을 미리 처리하여 시작합니다.
몇 초 원심 분리 후 스윙 버킷 로터에서 플레이트를 헹구고 따뜻한 바질 매체 2 밀리리터로 각각 잘 헹구습니다. 현미경 아래의 플레이트를 관찰하여 마이크로 우물에서 거품이 완전히 제거되었는지 확인합니다. 거품이 관찰되지 않으면 각 우물에 따뜻한 DMEM 지하 막 매트릭스 배지의 1 밀리리터를 추가하기 전에 우물을 다시 헹구십시오.
스페로이드 형성을 유도하기 위해, 10%FBS 및 1%항생제로 보충된 DMEM의 10센티미터 접시에서 2D 모노 층에서 Caco-2 세포의 원하는 농도를 참조하십시오. 가습 된 대기에서 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %의 문화. 80%의 합류에 도달하면 PBS5 밀리리터로 세포를 세척한 후 트립신-EDTA 2밀리리터로 배양을 섭씨 37도에서 2~5분 동안 치료합니다.
세포가 분리되면 트립신을 완전한 DMEM의 4 밀리리터로 중화시다. 계산 후, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 잘 당 중간 의 1 밀리리터에서 세포의 원하는 농도를 달성하기 위해 DMEM 지하 막 매트릭스 매체의 적절한 부피에서 팔레트를 다시 중단. 선불 24 웰 플레이트의 각 웰에 세포의 1 밀리리터를 추가한 다음, DMEM 지하 막 매트릭스 배지의 1밀리리터를 각 웰에 첨가한다.
파종 후 즉시 플레이트를 원심분리하고 가벼운 현미경을 사용하여 세포가 마이크로 우물을 통해 균등하게 분포되었는지 확인합니다. 그런 다음 세포를 방해하지 않고 48 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 구문 류를 수확하려면, 잠복기의 끝에, 부드럽게 마이크로 우물에서 스페로이드를 제거하기 위해 각 우물에 세로지 피펫과 슈퍼 나탄의 절반을 사용합니다.
모든 스페로이드가 분리되면 파이펫을 사용하여 3D 배양을 각 웰에서 15 밀리리터 원내 튜브 위에 37 미크로너 가역 스트레이너로 조심스럽게 전송합니다. 세척당 예온 된 기초 매체 1 밀리리터로 각각 세 번 씻고 나머지 스페로이드를 수집하고 스트레이너에 이러한 추가 스페로이드를 추가하십시오. 마지막 세척 후 현미경의 밑에 접시를 확인하여 모든 스페로이드가 마이크로 우물에서 제거되었는지 확인합니다.
그런 다음 새로운 15 밀리리터 튜브를 통해 여과기를 반전하고 튜브에 스페로이드를 수집하기 위해 신선한 DMEM 지하 막 매트릭스 매체로 여과자의 바닥을 세척합니다. 스페로이드는 500 세포에서 상승하고 시간이 지남에 따라 크기가 가장 균일한 증가를 보여줍니다. 스페로이드 당 500 및 600 세포와 좋은 성장과 낮은 가변성을 달성 할 수있는 세포의 최적 수로 결정.
지하 멤브레인 매트릭스의 첨가는 스페로이드 성장과 균질성을 향상시킵니다. 장기 배양에서 세포는 3일째에 조밀한 다층으로 나타납니다. 모노 층으로 배열된 평평한 셀은 10일째에 선명하게 보입니다.
흥미롭게도, 루멘은 5 일째부터 스페로이드 안에 나타납니다. 또한, 세포 핵항균 양성세포의 명확한 증가는 10일째에 감소하는 5일과 7일에 관찰된다. 놀랍게도, 활성화된 Caspace 3는 3일과 5일에만 극소수의 세포에서 관찰된다.
베타 카세닌 발현의 높은 수준은 매 지점에서 관찰됩니다. 안테로 사이트로 분화하는 스페로이드의 잠재력은 알칼리성 포스파타제와 솔루트 캐리어 가족 2A5 mRNA 발현에 의해 입증된다. 또한, 이러한 스페로이드는 전형적인 암 줄기세포 마커를 발현하고 대장암 환자에게 일상적으로 투여되는 조합 화학요법 치료에 반응한다.
그래서 스페로이드는 다른 세포 집단으로 구성됩니다. 그(것)들은 그 때 굴절제와 같은 자극에 세포 특이적 반응을 분석하고 결국 약 반응을 위해 잘 이용될 수 있습니다.
