NS65819 (CDJ, TO), NS049720 (CDJ), CA097257 (CDJ, TO), CIRM DR1 - 01426 우리는 기술 지원을 라켈 산토스 감사하고 싶습니다.

1. 체계적 전달 방법 약물의 전신 배달 CNS 높은 약물 농도를 달성하기위한 가장 효율적인 방법은 아니지만, 체계 배달이 편리하고 잘 환자로 받아들였습니다. 정맥 주사, intraperitoneal 주사 및 경구 gavage : 여기, 우리는 세 일상적으로 사용하는 조직 관리 방식에 대한 적절한 절차를 보여줄 것입니다. A. 정맥 주입 (타일 베인 사출) <ol><li> 절차를 시작하기 전에, 각 마우스의 체중이 기록되어야합니다. 모든 잠복기 연구와 마찬가지로, 체중은 잠재적 약물 독성을 평가하기 위해 (일주일에 두 번 이상) 정기적으로 모니터링해야합니다. 볼륨에서 마우스의 체중의 2 개 이상의 %는 한 번에 주입해야합니다. 예를 들어, 더 이상 유체의 0.2mL 이상은 20g 마우스에 주입해서는 안됩니다. 정맥 주입 모든 유체는 적절한 방법으로 소독하여야한다. </li><li> 마우스는 가열 패드 또는 꼬리 정맥을 팽창하기 위해 가열 램프을 사용 5~10분위한 워밍업해야합니다. 가열 램프를 사용하는 경우 고열을 피하기 위해 항상 마우스를 모니터합니다. </li><li> 마우스는 꼬리 정맥 (동영상 참조)에 대한 액세스를 허용하는 동안 마우스를 멈출 들고 장치로 전송됩니다. 마우스 꼬리 네 개의 보이는 선박이 있습니다 지느러미와 측면 양쪽에있는 혈관은 정맥, 그리고 복부 측면에있는 혈관은 동맥이다. 꼬리 정맥에 액세스하려면 마우스의 꼬리가 가장 말초 지점에서 개최하고, 정맥은 위쪽에 직면하고 있다고 90도 너무 회전합니다. 사출 사이트는 알코올 면봉과 함께 청소하고 28g 인슐린 주사기는 (동영상 참조) 정맥에, beveled 측면을 삽입됩니다. 바늘이 제대로 정맥에 배치하는 경우, 그것은 자유롭고 부담없이 이동해야합니다. 천천히 5-10초여도 압력과 마약을 주입. 물집이 꼬리에 나타나면 이것은 바늘이 혈관에 더 이상 없다는 것을 나타냅니다로, 주입을 중지합니다. </li><li> 출혈이 멈출 때까지 주사 후 주사 사이트에 부드러운 압력을 적용합니다. 이것은 일반적으로 30~60초 걸립니다. 더 이상의 출혈이 없다는 것을 막기 위해 사출 후 50-10분 마우스를 모니터합니다. </li></ol> B. Intraperitoneal 사출 <ol><li> 주입을 시작하기 전에 약물은 28g 바늘에 연결된 주사기에로드해야합니다. 공간 (예, 200μL를 주입하면 주사기 용량 300μL 이상 있는지 확인) 사출하기 전에 플런저를 다시 그리기 위해 주사기 안에 있는지 확인합니다. </li><li> 마우스 손잡이에 뭔가가있다 있도록 꼬리로 새장에서 마우스를 제거하고 거친 표면에 그것을 놓으십시오. 케이지 뚜껑은 대개 충분합니다. 마우스는 몸을 스트레칭하고 다음 비 지배적인 손을 사용하는 허용 가볍게 당신의 엄지와 검지와 가운데 손가락 (동영상 참조) 사이에 최대한 피부를 꼬집어보고를 돌보는 마우스의 뒷면에있는 피부를 파악. 그래서 마우스의 복부가 위쪽에 직면하고 있다고 위로 마우스를 켭니다. 마우스가 자유롭게 머리를 이동할 수있다면, 사출 동안 물리지 않도록을 줄 수있는만큼, 손잡이를 해제하고 다시 시도하십시오. </li><li> 당신의 지배적인 손으로 주사기를 선택하고 마우스의 왼쪽 하단 사분면 (동영상 참조)에 30도 각도로 바늘을 삽입합니다. 약간 거꾸로 마우스를 개최하는 것은 멀리 주사 사이트에서 장기를 이동하는 데 도움이됩니다. 바늘이 intraperitoneal 공간에 있는지 확인하려면 주사기의 플런저에 다시 가져옵니다. 어떤 액체 또는 혈액이 주사기에 나타나는 경우, 바늘은 intraperitoneal 공간이 아니므로 삭제되어야합니다. 어떤 유체가 주사기에 aspirated 없다면, 1~5초 이상도 압력과 주사기의 내용을 삽입하고 마우스를 놓습니다. </li><li> 마우스가 정상적인 활동 수준을 반환하기 위해 사출 후 5~10분 마우스를 모니터합니다. </li></ol> C. 구두 Gavage <ol><li> 주사를 시작하기 전에 마우스의 무게를 기록합니다. 경구 gavage에 의해 제공 수있는 최대 볼륨은 체중 kg 당 10mL입니다. 예를 들어, 20g 마우스의 최대 볼륨은 200μL 것입니다. 큰 볼륨을 삽입하려고 시도하는 것은 역류가 발생할 수 있습니다, 이것은 불완전 약물 전달의 원인이됩니다. 그것이 위에 명시된 것보다 더 큰 볼륨을 관리하는 데 필요한 경우, 많은 셋처럼 복용 24 시간 이상 실시 수 있습니다. </li><li> 식도를 펑쳐링 방지하기 위해서는 각각의 마우스에 대한 gavage 바늘의 길이를 측정하는 것이 중요합니다. 마우스의 마지막 늑골에 gavage 바늘을 곡선 18g 볼 팁을 보유하고 영구 마커 (동영상 참조)를 사용하여 마우스의 머리의 끝에 길이를 표시합니다. gavage 동안,이 마크는 마우스의 입안에 바늘을 삽입으로 막는 포인트가 될 것입니다. </li><li> intraperitoneal 주사 같은 손으로 손잡이를 사용하여 마우스를 구속. 혀여, 입안에 gavage 바늘을 삽입하고 adva인두를 통해 바늘을 제정신. 중지 마르크 과거 바늘을 삽입하지 마십시오. 바늘은 어떤 압력 (비디오 참조)없이 원활하게 진행해야합니다. 당신이 압력을 발생하면 중지하고 폐 속에 유체를 주입하지 않도록하기 위해 바늘을 철회. </li><li> 장소에 바늘로, 1~5초 통해 플런저를 우울하게하고 그것이 삽입된 것을 동일한 각도로 바늘을 제거합니다. 그 액체가 폐에를 입력했습니다 나타낼 수 있습니다 고심한 흔적이있는 호흡의 흔적에 가까운주의를 기울이고, 50-10분 마우스를 모니터합니다. </li></ol> 2. 로컬 배달 급성 대류 - 향상된 배달 A. 프로브 건설 설치류를위한 역류 방지 CED 정맥은 아직 상업적으로 사용할 수 없습니다. 여기 처음 Krauze 외 (Krauze 2005)에 의해 설명된 방법으로 적응했다 정맥 건설하는 방법을 설명합니다. <ul><li> 100uM 직경 실리카 튜브이를 통해 infusate 흐름, 구조 지원을위한 단단한 금속 바늘과 infusate 로딩을위한 유연한 테플론 튜브 :. 정맥은 세 부분 (그림 1)을 가지고 </li><li> 단단한 금속 바늘을 얻으려면, Surflo IV 카테터 (24g 탐침)에 플라스틱을 녹일와 족집게는 금속 바늘을 제거 사용하는 열린 불꽃을 사용합니다. 카테 테르의 나머지는 폐기 수 있습니다. 단일 에지 면도날을 사용하여 금속 바늘보다 약간 긴 실리카 튜브의 길이 (OD 0.163mm)를, 잘라. 튜브의 끝에 어떤 접착제를 못 돌보는 cyanoacrylate을 기반으로 빠른 속도로 연기 접착제 (예 : Krazy 풀로)의 작은 드롭 역할 실리카 튜빙. 금속 바늘의 실리카 튜브를 삽입하고 5 분 말리면. </li><li> 일단 건조 실리카 튜빙은 단단히 바늘에 부착된해야합니다. 이산화 규소의 끝을이 줄어들 수 있도록해야한다는 바늘과 평면 끝 (비디오 참조)로부터 실리카 튜빙의 protrudes의 3mm의 지적 끝에서 실리카 튜빙의 protrudes의 2mm. </li><li> 길이 테플론 튜브 20cm의 부분을 잘라 버릴거야. 다시 이것은 정맥을 방해할 수 있으므로 실리카 튜브의 끝에 접착제를하지 돌보는, 접착제의 작은 방울의 금속 바늘을 롤. 1cm의 깊이에 테플론 튜브에 바늘을 삽입합니다. 1 분 건조하자. 아교 총 사용하여 금속 바늘과 테플론 튜브 (동영상 참조) 사이의 공동에 뜨거운 접착제 한 방울을 적용합니다. 전체 관절이 사방에 덮여 있는지 확인하고 최소 1 시간 동안 건조하자. Cannulas 미리 주일까지 만들어 실온에서 저장할 수 있습니다. </li></ul> B. 주입 절차 <ul><li> 외과 영역을 준비하려면, 모든 표면과 같은 2 % chlorhexidine 솔루션으로 살균제와 뿌렸해야합니다. 무균 수술 장갑이 절차를 수행하는 동안 착용해야합니다. 표면은 다음 흡수 커튼 덮여있다. 다음과 같은 소모품은 외과 영역에 배치되어야합니다 <ul><li> 마우스 체온을 유지하기 위해 가열 패드 </li><li> 2 % chlorhexidine을 포함한 3 % 과산화수소를 포함하는 하나 하나, 2 작은 배양 접시 </li><li> 무균 거즈 및 면화 면봉 </li><li> 멸균 일회용 scalpels (번호 21) </li><li> 무균 바늘 22g </li><li> 마우스 stereotaxic 프레임 </li><li> 제어 속도 주사기 펌프 </li><li> Autoclaved 마우스 피부 스테플러, 스테이 플스, 그리고 주요 제거 </li></ul></li><li> CED 정맥을 설정하려면, 플라스틱 주사기 어댑터 세트를 사용하여 테플론 튜브에 1mL 주사기를 첨부합니다. 그것이 (비디오 참조) 수술 표면에 직각이되도록 정맥은 stereotaxic 프레임에 부착된해야합니다. 정맥을 소독하기 위해, 70 % 에탄올로 1mL 주사기를 입력하고 정맥을 통해 에탄올을 실행하는 플런저를 우울. 멸균 생리를 사용하여이 과정을 반복하고, 정맥의 관절 주변에 누출이 있는지 확인합니다. 정맥의 외부를 소독하기 위해 부드럽게 70 % 에탄올로 닦아 닦아. </li><li> 무균 식염수에 정맥을 작성하고 작은 기포가 정맥에 그려진되도록 주사기에 다시 가져옵니다. 공기 방울이의 정맥에있는 호수에서 infusate을 분리합니다. 그런 다음, backload하여 infusate (동영상 참조). 간단히 정맥을 실행하여 주사기 펌프 및 주요 펌프에 주사기를 연결합니다. </li><li> 주입 마취 및 멸균 거즈 조각으로 여러 번 (5-10 초 동안) 보라고하여 피부를 준비를 사용하여 진정 마우스는 2 % chlorhexidine 솔루션에 담근. 안과 연고는 절차를 수행하는 동안 충분한 수분을 유지하기 위해 마우스에 적용해야합니다. 멸균 메스를 사용하여 (동영상 참조) 길이 약 1.5cm, 두개골의 중심을 따라 화살 절개를 만듭니다. 두개골 표면은 다음 3 % 과산화수소 용액에 담가 면봉을 사용하여 청소합니다. 마우스의 눈에 과산화수소를 받고 않도록 조심해. 두개골의 봉합 라인이 시점에서 분명해야합니다 그들이 표시되지 않은 경우, 부드럽게 동생과 함께 두개골을 면봉에쉬 커튼 면봉 3 %의 과산화수소 용액에 담가. </li><li> 주입 사이트를 찾을 수 bregma (그림 2) 다음 오른쪽으로 2mm를 측정하고이 구조의 1mm의 후부를 식별합니다. 멸균 22g 바늘을 사용하여 부드럽게 두개골 (비디오 참조)에 대한 바늘을 복잡하게이 시점에서 두개골에 구멍을 만듭니다. 두개골에 대한 아래 바늘을 강요하지 마십시오. </li><li> 이 시점에서 마우스가 stereotaxic 프레임에 배치하고 흡입 마취제를 (비디오 참조) 전송이 시작되어야합니다. 낮은 수준 (1 %)에서 마취를 관리하고, 신중하게 따라 마취 조정, 호흡 속도의 변화에​​ 대한 마우스를 모니터합니다. </li><li> 두개골 구멍을 통해 정맥 후 두개골 표면 아래 낮은 3mm를 놓습니다. 다음과 같은 요금 및 기간이을 사용하여 주입을 시작 : <table border="0"><tbody><tr><td> 0.1 μL / 5 분 분 </td><td rowspan="5"><img src="/files/ftp_upload/1992/1992tablefigure.png" alt="총 볼륨 10 UL" /></td></tr><tr><td> 0.2 μL / 5 분 분 </td></tr><tr><td> 0.5 μL / 5 분 분 </td></tr><tr><td> 0.8 μL / 7.5 분 분 </td></tr><tr><td> OFF 1 분 </td></tr></tbody></table></li><li> 주입의 끝에서 천천히 정맥 및 면봉 3 % 과산화수소로 두개골을 제거합니다. (동영​​상 참조) 구멍에 멸균 뼈 왁스를 적용합니다. 포셉을 사용하여 가까운 두개골과 주식을 통해 함께 피부를 그립니다. Buprenorphine의 게시가 수술 통증에 대한 관리해야합니다. </li><li> 그것이 의식과 이동성을 차릴 때까지 사후 operatively 마우스를 모니터합니다. 때문에 프로 시저의 길이에, 그것은 모든 활동을 회복하기 위해 마우스를위한 시간까지 걸릴 수 있습니다. 이 시간 장소 동안 가열 패드에서 마우스 케이지는 저체온증을 방지하고, 다른 적극적인 생쥐와 복구 마우스를 집에서하지 않습니다. </li><li> 스킨 스테이플은 수술 후 일주 제거되어야합니다. </li></ul> VIVO 이미징에서 C. 찬란 - 표시 infusate는 CED 관리 다음과 같은 몇 군데있을 수 있으며, 신호 강도의 변화뿐만 아니라 신호 위치를 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로, 그것은 마우스를 주입에서 회복하도록 않도록, 이미지에 주입 후 2~3시간를 기다리는 것이 좋습니다. <ul><li> 이미징 동안 마취 들어, 흡입 마취의 낮은 수준을 사용합니다. 위치 마우스, 이미징 역에서 지느러미 측면 (예, IVIS 루미나, 칼리퍼 생명 과학, 알라 메다, CA). 몇 군데되는 플루어에 적절한 필터 설정을 사용하여 이미지를 획득. CED 들어, 성공적인 주입은 주입 사이트 (그림 3) 근처에있는 두뇌에있는 물질의 대부분을 표시합니다. </li></ul> 3. 대표 결과 치료의 행정 불리한 반응의 부족 성공적으로 분사의 중요한 지표이다. 예를 들어, 꼬리 정맥 주사 다음과 꼬리 모양의 변화 (예, 크기, 색상)가 없어야합니다. 꼬리 정맥 주입 다음 거품이나 물집은 피하 아닌 치료의 정맥, 납품을 나타내는 것입니다. intraperitoneal 주사 들어, 복부의 피부 변색의 충돌은 피하 주사 또는 내부 구조에 손상을 나타낼 수 있습니다. 경구 gavage에서와 마우스가 호흡이나 기침하는 것을 유체가 오히려 위장으로보다 폐에 주입되었다 나타낼 수 있습니다 보람. CED 들어, neurologic 기능은 치료의 성공적인 관리를 평가하기위한 중요합니다. 발작 또는 hemiparesis을 전시됩니다 마우스 부적 절한 주입을 받으셨을 것입니다. 형광 infusate를 사용하는 경우, 생체내 이미징 성공적으로 관리합니다 (그림 3) 평가에 대해 적용할 수 있습니다. infusate가 주사의 사이트 언어 있지 않다면, 주입은 성공적으로 완료되지 않은 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : CED 정맥 및 설정 외과. 대류 강화된 전달의 기본 요소는 수술이 설정 표시됩니다. microinfusion 펌프 (A)는 (B, 상단에있는 확대 그림 참조) 주입관에 첨부되어 있습니다. stereotaxic 프레임 (C)는 프로브를 위치로 사용됩니다. 이 이미지는 난방을 포함하지 않으며 마취 장비는 또한 절차를 수행하는 동안 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : 마우스 스컬 봉합해 라인. CED 주입 사이트 (레드 스타)은 화살과 코로나 봉합 (bregma)의 교차로를 식별하고 bregma의 2mm 수평 및 1mm는 사후 측정하여 찾을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 : 성공 CED의 대표 결과. 리멀리 붉은 형광 염료로 분류 posomes는 CED에 의한 마우스 뇌에 주입 및 생체내 및 전직의 생체내 두 군데 있었다. 성공적인 주입은 생체내 (A)와 예 생체내 (B) 두 주입의 사이트 언어 형광 신호를 보여줍니다. 신호는 contralateral 북반구에 누설하지 않고 주입 뇌를 현지해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4 : 랫 Brainstem에 성공 CED 대표 이미지. 찬란 - 표시 liposomes은 쥐의 brainstem에 주입했다. 쥐에서 많은 20μL로이 들어갈 수 있습니다. 쥐의 두개골과 생체내 이미징에서 배제 주입 깊이 있지만, 올바른 주입 위치의 증가 두께는 해부하는 뇌의 전 생체내 이미징에서 확인할 수 있습니다.

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> J Neurosurg. 107, 560-567 (2007).</li><li>Yamashita, Y., Krauze, M. T., Kawaguchi, T., Noble, C. O., Drummond, D. C., Park, J. W., Bankiewicz, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+a+topoisomerase+I+inhibitor+(nanoliposomal+topotecan)+and+a+topoisomerase+II+inhibitor+(pegylated+liposomal+doxorubicin)+in+intracranial+brain+tumor+xenografts.">Convection-enhanced delivery of a topoisomerase I inhibitor (nanoliposomal topotecan) and a topoisomerase II inhibitor (pegylated liposomal doxorubicin) in intracranial brain tumor xenografts.</a> Neuro Oncol. 9, 20-28 (2007).</li></ol>

모든 절차를 여기서 보여주는 UCSF 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

어떤 치료 요원의 효능의 잠복기 평가 에이전트 계정의 약리 특성과 관심의 대상 조직으로해야합니다. 행정 체계적 방법 일반적으로보다 손쉬운 더 나은 환자에 의해 용납되지만, 혈액 뇌 장벽의 선택도는 종종 CNS 질환 치료를위한 치료의 로컬 배달을 요구. CED : 여기, 우리는 두뇌에 직접 전달 방법 중 하나를 증명하고있다. 뇌에 로컬 배달의 다른 형태의 뇌척수, intratumoral 볼러스 주입하고, 심실 사출에 직접 관리를 포함합니다. 이러한 방법의 경우, 치료의 diffusibility는 가난한 확산은 사출 사이트 (쟁 1989, 보보 1994)에서 몇 mm로 적용 범위의 영역을 제한 함께 매우 중요합니다. 반대로, CED는 아직 구체적인 치료 neuroanatomical 구조 타겟팅을 사용하면서, 마약 유통 (보보 1994)의 영역을 높이기 위해 긍정적인 압력을 사용합니다. 저희 연구실에서는, 우리는 성공적으로 수행 brainstem에뿐만 아니라 설치류에 꼬리가있는 putamen (그림 4)에 CED있다. 설치류 모델에서 CED 수행하는 능력은 CNS 질환의 다양한 유형을 치료하면 치료 효능을 극대화 증가 관심과 공동으로 점점 더 중요 해지고있다. CED는 정화 단백질, 작은 분자 약물 및 바이러스 (길 2003, Degen 2003 Szerlip 2007)을 포함한 에이전트의 다양한, 전달하는 데 사용할 수 있습니다. CED로 치료할 수 질병의 범위는 CNS의 암 (야마시타 2007)뿐만 아니라 파킨슨병 (길 2003)로 neurodegenerative 질병을 포함하고 있습니다. CED 연구, CED 관리 치료의 생체내 이미징에의 ​​필요성을 확대 지속으로 유사하게 증가하고 있습니다. 형광 이미징 가능성이 인간의 두개골을 통해 보이지 않을 여기를 시연하는 동안 MRI 대비 요원의 공동 주입 (디킨슨 2008) 채용 다른 방법 CNS 질환 환자에서 infusates을 모니터링에 대한 적용을 평가에 대한 관심을 받고있다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2% Chlorhexidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9756995</td>
<td>AKA &#x201C;Nolvasan&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>20g Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>28g Needle (with syringe)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-004-270</td>
<td>AKA Insulin Syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>3% Hydrogen Peroxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>H312P-4</td>
<td>Store away from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton Swabs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>23-400-100</td>
<td>Autoclave before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate-based Adhesive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9592632</td>
<td>AKA &#x201C;Krazy Glue&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable Scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Feather</td>
<td>2975</td>
<td>No. 21</td>
</tr>
<tr>
<td>Gauze</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22028563</td>
<td>Autoclave before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Heating Pad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dunlap</td>
<td>HP950</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I.V. Catheter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
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<td>1520</td>
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<td>&nbsp;</td>
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<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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systemic and local drug delivery for treating diseases of the central nervous system in rodent models

중추 신경계 (CNS)의 철저한 테스트 잠복기 치료제는 치료 효능을 평가 관리 및 에이전트 biodistribution의 노선의 고려를 포함합니다. 행정의 두 가지 주요 분류 사이에, 지역 대 체계, 체계 배달 방법은 종종 관리의 용이성으로 인해 선호하고 있습니다. 그러나, 체계 배달은 CNS에 달성되는 suboptimal 약물 농도의 결과 및 에이전트 효능에 관한 잘못된 결론으로​​ 이어질 수 있습니다. 지역 약물 전달 방법은 더 침략하지만, 치료 CNS 마약 수준을 달성하기 위해 필요할 수 있습니다. 정맥 주사, intraperitoneal 주사 및 경구 gavage : 여기, 우리는 체계적 약물 전달의 세 노선에 대한 적절한 방법을 보여줍니다. 대류 향상된 배달 (CED) : 또한, 우리는 두뇌로 로컬 배달하는 방법을 보여줍니다. 찬란 - 분류 화합물의 사용은 적절한 약물 관리의 생체내 이미징 및 검증에 대해 포함되어 있습니다. 방법 murine 모델을 사용하여 제공됩니다,하지만 쉽게 쥐에 사용하기 위해 적용할 수 있습니다.

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Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

중추 신경계의 행동 약물의 철저한 잠복기 테스트는 종종 평가 및 관리의 구체적인 노선과 공동으로 마약 biodistribution을 비교를 포함합니다. 여기 세 일반적으로 사용되는 체계 배달 방법 (정맥 intraperitoneal, 그리고 구두)뿐만 아니라 로컬 배달하는 방법 (대류 향상된 전송)은 생쥐에서 증명하고 있습니다.

쥐 모델에서 중추 신경계의 질병 치료를위한 체계와 지역 마약 배달

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

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30.3K 조회수.  University of California, San Francisco - UCSF. 중추 신경계의 행동 약물의 철저한 잠복기 테스트는 종종 평가 및 관리의 구체적인 노선과 공동으로 마약 biodistribution을 비교를 포함합니다. 여기 세 일반적으로 사용되는 체계 배달 방법 (정맥 intraperitoneal, 그리고 구두)뿐만 아니라 로컬 배달하는 방법 (대류 향상된 전송)은 생쥐에서 증명하고 있습니다.

비디오: Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

연구

신경과학

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...