NS65819 (CDJ, TO), NS049720 (CDJ), CA097257 (CDJ, TO), CIRM DR1-01.426 Gostaríamos de agradecer a Raquel Santos para assistência técnica.

1. Sistêmica Métodos de entrega Apesar de administração sistêmica de drogas não é a abordagem mais eficiente para atingir concentrações elevadas de drogas no SNC, as entregas sistêmica são convenientes e bem aceito pelos pacientes. Aqui, iremos demonstrar os procedimentos adequados para três abordagens de rotina usado administração sistêmica: a injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, e gavagem oral. A. injeção intravenosa (injeção veia da cauda) <ol><li> Antes de iniciar o procedimento, o peso corporal de cada rato devem ser registrados. Como em todos os estudos pré-clínicos, o peso corporal deve ser monitorada regularmente (duas vezes por semana ou mais) para avaliar a toxicidade potencial da droga. Não mais do que 1% do peso corporal do rato no volume deve ser injetado em uma única vez. Por exemplo, não mais que 0,2 mL de líquido deve ser injetado em um rato 20g. Todos os fluidos injetados por via intravenosa devem ser esterilizados por um método apropriado. </li><li> O mouse deve ser aquecido por 5-10 minutos usando uma almofada de aquecimento ou de uma lâmpada de calor para dilatar a veia da cauda. Se estiver usando uma lâmpada de calor, monitorar o mouse em todos os momentos para evitar hipertermia. </li><li> O mouse é transferido para um dispositivo de fixação, que restringe o mouse, permitindo o acesso à veia caudal (ver vídeo). Na cauda do rato, existem quatro vasos visíveis: os vasos nos lados dorsal e lateral são veias, eo navio no lado ventral é uma artéria. Para acessar a veia da cauda, ​​a cauda do rato é realizada no ponto mais distal, e rotação de 90 graus, para que a veia é voltado para cima. O local da injeção é limpo com um algodão embebido em álcool e uma seringa de insulina 28g é inserido, o lado chanfrado para cima, para dentro da veia (ver vídeo). Se a agulha está correctamente colocada na veia, ela deve mover-se livremente e sem pressão. Lentamente injetar a droga, mesmo com a pressão mais de 5-10 segundos. Se uma bolha aparece na cauda, ​​pare de injetar, pois isso indica que a agulha não está mais na veia. </li><li> Após a injeção, aplique uma leve pressão no local da injeção até que o sangramento pare. Isso normalmente leva 30-60 segundos. Monitorar o mouse por 5-10 minutos após a injeção para assegurar que não há mais sangramento. </li></ol> B. injeção intraperitoneal <ol><li> Antes de iniciar a injeção, a droga deve ser carregado em uma seringa conectada a uma agulha 28g. Certifique-se que há espaço na seringa para desenhar o êmbolo antes da injeção (por exemplo, se injetar 200μL, certifique-se que a capacidade da seringa é 300 ul ou superior). </li><li> Remova o mouse da gaiola por sua cauda e colocá-lo em uma superfície texturizada, para que o mouse tem algo a aderência. Uma tampa de gaiola é geralmente suficiente. Permitir que o mouse para esticar seu corpo e em seguida, usando sua mão não-dominante, segure a pele na parte de trás do rato, tendo o cuidado de ânimo leve pitada de pele, tanto quanto possível entre o polegar eo dedo indicador e médio (ver vídeo). Vire o mouse de forma que o abdômen do mouse é virada para cima. Se o rato pode se mover livremente sua cabeça, solte a pegada e tentar novamente, de forma a evitar ser picado durante a injecção. </li><li> Com sua mão dominante, pegar a seringa e insira a agulha em um ângulo de 30 graus no quadrante inferior esquerdo do mouse (ver vídeo). Segurando o mouse ligeiramente invertida vai ajudar a mover os órgãos de distância do local da injeção. Para garantir que a agulha está no espaço intraperitoneal, puxe o êmbolo da seringa. Se qualquer líquido ou sangue aparece na seringa, a agulha não está no espaço intraperitoneal e deve ser removido. Se nenhum líquido é aspirado para dentro da seringa, em seguida, injetar o conteúdo da seringa com uma pressão ainda mais de 1-5 segundos e solte o mouse. </li><li> Monitorar o mouse por 5-10 minutos após a injeção para assegurar que o mouse volta a níveis de atividade normal. </li></ol> C. Oral Gavage <ol><li> Antes de iniciar a injeção, registro do peso do mouse. O volume máximo que pode ser entregue por sonda oral é 10 ml por quilo de peso corporal. Por exemplo, o volume máximo de um rato 20g seria 200μL. A tentativa de injetar grandes volumes pode resultar em refluxo, o que fará a entrega da droga incompleta. Se for necessário administrar volumes maiores que as apontadas acima, até três doses podem ser administradas mais de 24 horas. </li><li> Para evitar a perfuração do esôfago, é importante para medir o comprimento da agulha gavagem para cada rato. Segure uma ponta de bola de 18g-agulha curvo gavagem na última costela do mouse, e depois marcar o comprimento da ponta da cabeça do rato usando um marcador permanente (ver vídeo). Durante a gavagem, a marca será um ponto de parada ao inserir a agulha na boca do mouse. </li><li> Contenha o mouse usando o aperto de mão mesmo que para uma injeção intraperitoneal. Inserir a agulha gavagem na boca, sobre a língua, e advance a agulha através da faringe. Não insira a agulha após a marca de parar. A agulha deve prosseguir sem problemas, sem qualquer tipo de pressão (ver vídeo). Se você encontrar a pressão, parar e retirar a agulha para evitar a injeção de fluidos nos pulmões. </li><li> Com a agulha no lugar, o êmbolo mais 1-5 segundos e depois retire a agulha no mesmo ângulo que foi inserido. Monitorar o mouse por 5-10 minutos, prestando muita atenção a qualquer sinal de dificuldade para respirar que pode indicar que o fluido tenha entrado no pulmão. </li></ol> 2. Entrega Local Aguda Convecção-Enhanced Entrega A. Construção da sonda A cânula refluxo resistente CED para roedores ainda não é comercialmente disponível. Aqui vamos demonstrar um método para a construção de cânula que foi adaptado de um primeiro método descrito por Krauze et al (Krauze 2005). <ul><li> A cânula tem três partes (Figura 1): tubo de sílica 100um de diâmetro através do qual os fluxos infusato, uma agulha de metal rígido para o apoio estrutural e flexível tubo de Teflon para carregar o infusato. </li><li> Para obter a agulha de metal rígido, use uma chama para derreter o plástico em um cateter IV Surflo (24g estilete) e usando uma pinça retire a agulha de metal. O resto do cateter pode ser descartada. Corte um pedaço de tubo de sílica (OD 0,163 milímetros), ligeiramente mais longo que a agulha de metal, utilizando uma lâmina de barbear única de ponta. Tubo de papel da sílica em uma pequena gota de cianoacrilato cola de ação rápida com base (por exemplo, Krazy Glue), tomando cuidado para não deixar nenhuma cola nas extremidades do tubo. Insira o tubo de sílica na agulha de metal e deixe secar por 5 minutos. </li><li> Depois de seco, o tubo de sílica deve ser solidamente fixado sobre a agulha. As extremidades da sílica devem ser aparadas para que se projeta 2mm de sílica tubulação da extremidade pontiaguda da agulha e 3 milímetros de tubos de sílica se projeta a partir da extremidade plana (ver vídeo). </li><li> Cortar uma seção de tubo de Teflon 20 cm de comprimento. Rolo da agulha de metal em uma pequena gota de cola, novamente tomando cuidado para não se cola nas extremidades do tubo de sílica como este vai obstruir a cânula. Inserir a agulha no tubo de Teflon a uma profundidade de 1cm. Deixe secar por 1 minuto. Usando uma pistola de cola, aplique uma gota de cola quente para a articulação entre a agulha de metal eo tubo de Teflon (ver vídeo). Assegurar que todo o conjunto é coberto por todos os lados e deixe secar por pelo menos 1 hora. Cânulas podem ser feitas até uma semana de antecedência e armazenado em temperatura ambiente. </li></ul> B. Procedimento de Infusão <ul><li> Para preparar a área cirúrgica, as superfícies devem ser pulverizadas com um desinfectante, como uma solução de clorexidina a 2%. Luvas cirúrgicas estéreis, devem ser usados ​​durante o procedimento. As superfícies são então cobertas com cortinas absorventes. As fontes a seguir deve ser colocado na área cirúrgica: <ul><li> Almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do rato </li><li> Duas pequenas placas de Petri, um contendo peróxido de hidrogênio 3% e uma contendo clorexidina a 2% </li><li> Swabs estéreis gaze e algodão </li><li> Bisturis descartáveis ​​estéreis (Número 21) </li><li> Estéreis as agulhas 22g </li><li> Rato estereotáxica quadro </li><li> Bomba de seringa taxa controlada </li><li> Autoclavado pele do rato grampeador, grampos, e removedor de grampos </li></ul></li><li> Para configurar a cânula CED, anexar uma seringa 1 ml para o tubo de Teflon usando um conjunto de adaptadores de seringa de plástico. A cânula deve ser afixada no quadro de estereotáxica para que seja perpendicular à superfície cirúrgica (ver vídeo). Para desinfetar a cânula, encha a seringa com 1 ml de etanol 70% e pressionar o êmbolo para executar o etanol através da cânula. Repita esse processo com solução salina estéril, e verificar se há algum vazamento em torno das articulações cânula. Para desinfetar a parte externa da cânula, limpe com um álcool 70% limpe. </li><li> Preencher a cânula com solução salina estéril e, em seguida, puxe seringa de modo que uma pequena bolha de ar é atraído para a cânula. Esta bolha de ar vai separar o infusato da solução salina na cânula. Então, protelar o seu infusato (ver vídeo). Conectar a seringa à bomba de seringa e bombear o prime rodando por breves instantes, a cânula. </li><li> Sedar o rato usando um anestésico injetado e preparar a pele limpando várias vezes (por 5-10 segundos) com um pedaço de gaze estéril embebida em solução de clorexidina a 2%. Pomada oftálmica deve ser aplicado o mouse para manter a umidade adequada durante o procedimento. Utilizando um escalpelo esterilizado, criar uma incisão sagital ao longo do centro do crânio, aproximadamente 1,5 cm de comprimento (ver vídeo). A superfície do crânio é então limpo com um cotonete embebido em uma solução de 3% de peróxido de hidrogênio. Tome cuidado para evitar o peróxido de hidrogênio nos olhos do mouse. Linhas de sutura do crânio deve ser aparente neste ponto: se eles não estiverem visíveis, gentilmente limpe o crânio com um fresh cotonete embebido em solução a 3% de peróxido de hidrogênio. </li><li> Identificar o bregma (Figura 2) e em seguida medir dois milímetros para a direita e 1mm posterior desta estrutura para localizar o local de infusão. Usando a agulha estéril 22g, gentilmente criar um buraco no crânio, neste ponto, torcendo a agulha contra o crânio (ver vídeo). Evite forçar a agulha para baixo contra o crânio. </li><li> Neste ponto, o mouse deve ser colocado na armação estereotáxica e começar a receber anestesia inalatória (ver vídeo). Administrar o anestésico em um nível baixo (1%), e acompanhar atentamente o mouse para mudanças na taxa de respiração, ajustando o anestésico em conformidade. </li><li> Posição da cânula sobre o furo do crânio e abaixe 3 milímetros abaixo da superfície do crânio. Começar a infusão, utilizando as seguintes taxas e durações: <table border="0"><tbody><tr><td> 0,1 mL / min por 5 minutos </td><td rowspan="5"><img src="/files/ftp_upload/1992/1992tablefigure.png" alt="Volume total de 10 ul" /></td></tr><tr><td> 0,2 mL / min por 5 minutos </td></tr><tr><td> 0,5 mL / min por 5 minutos </td></tr><tr><td> 0,8 mL / min para 7,5 minutos </td></tr><tr><td> OFF por 1 minuto </td></tr></tbody></table></li><li> No final da infusão, lentamente, remova a cânula e swab crânio com peróxido de hidrogênio 3%. Aplicar cera de osso estéril para o buraco (ver vídeo). Utilizando uma pinça, tirar a pele junto sobre o crânio e grampo para fechar. Buprenorfina deve ser administrada no pós-operatório alívio da dor. </li><li> Monitorar o mouse no pós-operatório até que ele recobra a consciência e mobilidade. Devido à morosidade do processo, pode demorar até uma hora para o mouse para recuperar a plena atividade. Durante este tempo, lugar a gaiola do mouse sobre uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia, e não a casa do rato recuperando com outros ratos ativo. </li><li> Grampos de pele devem ser removidos uma semana após a cirurgia. </li></ul> C. In Vivo de imagem Infusato fluorescente-rotulados podem ser visualizados após a administração CED, e pode ser monitorado para mudanças na intensidade do sinal bem como a localização do sinal. Normalmente, é melhor esperar 2-3 horas após a infusão de imagem, de modo a permitir o mouse para se recuperar da infusão. <ul><li> Para anestesia durante o exame, use um baixo nível de um anestésico inalatório. Posicione o rato, o lado dorsal para cima, em uma estação de imagens (por exemplo, IVIS Lumina, Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Usando uma configuração apropriada de filtro para o fluor que está sendo fotografada, adquirir uma imagem. Para CED, uma infusão bem-sucedido deve mostrar a maioria do material no cérebro perto do local de perfusão (Figura 3). </li></ul> 3. Resultados representante A falta de reação adversa a administração da terapia é um importante indicador da injeção de sucesso. Por exemplo, após a injeção das veias da cauda não deve haver mudança na aparência (por exemplo, tamanho, cor) da cauda. Uma bolha ou blister a seguir à injecção veia da cauda indicaria subcutânea, em vez de entrega, por via intravenosa de terapia. Para injeções intraperitoneal, uma colisão na pele ou descoloração do abdómen pode indicar a injeção subcutânea ou danos a estruturas internas. Em gavagem oral, um mouse com dificuldade para respirar ou tossir pode indicar que o líquido era injetado para dentro dos pulmões, ao invés de para o estômago. Para CED, a função neurológica é importante para avaliar a administração de sucesso da terapia. Um rato que está apresentando convulsões ou hemiparesia pode ter recebido uma infusão impróprio. Se um infusato fluorescente é utilizado, in vivo de imagens pode ser aplicado para avaliar a administração bem sucedida (Figura 3). Se o infusato não está localizada no local da injeção, a perfusão não foi bem sucedida. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Cânula CED e Cirúrgica Set-up. Os elementos básicos da entrega de convecção-enhanced cirúrgica set-up são mostrados. Uma bomba microinfusion (A) é acoplada a uma cânula de infusão (B, em tamanho ampliado no topo). Uma moldura estereotáxica (C) é usado para posicionar a sonda. Esta imagem não inclui equipamento de aquecimento e anestésico usado também durante o procedimento. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Linhas de rato Suture Caveira. O local de infusão CED (estrela vermelha) podem ser localizados através da identificação da intersecção das suturas sagital e coronal (o bregma) e medindo 2 milímetros lateral e um milímetros posterior do bregma. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Resultados Representante do CED sucesso. Liposomes marcado com um corante vermelho-distante fluorescentes foram infundidas no cérebro de camundongos pelo CED e fotografado in vivo e ex vivo. A infusão de sucesso mostra um sinal fluorescente localizada no local da perfusão tanto in vivo (A) e ex vivo (B). O sinal deve ser localizada no hemisfério infundida sem fuga para o hemisfério contralateral. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Imagem Representante do CED sucesso no tronco cerebral de ratos. Lipossomas fluorescente-marcadas foram infundidas no tronco cerebral de ratos. Em ratos, tanto quanto 20μL pode ser infundido. O aumento da espessura do crânio de ratos e profundidade de injeção in vivo impedido de imagem, mas a localização de infusão correta pode ser verificada por meio de imagens ex vivo do cérebro dissecado.

<ol>
	<li>Bobo, R. H., Laske, D. W., Akbasak, A., Morrison, P. F., Dedrick, R. L., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2076-2080 (1994).</li><li>Degen, J. W., Walbridge, S., Vortmeyer, A. O., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+convection-enhanced+delivery+of+gemcitabine+or+carboplatin+in+a+malignant+glioma+model+in+rats.">Safety and efficacy of convection-enhanced delivery of gemcitabine or carboplatin in a malignant glioma model in rats.</a> J Neurosurg. 99, 893-898 (2003).</li><li>Dickinson, P. J., LeCouteur, R. A., Higgins, R. J., Bringas, J. R., Roberts, B., Larson, R. F., Yamashita, Y., Krauze, M. T., Noble, C. O., Drummond, D. C., Kirpotin, D. B., Park, J. W., Berger, M. S., Bankiewicz, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+model+of+convection-enhanced+delivery+of+liposomes+containing+CPT-11+monitored+with+real-time+magnentic+resonance+imaging:+laboratory+investigation.">Canine model of convection-enhanced delivery of liposomes containing CPT-11 monitored with real-time magnentic resonance imaging: laboratory investigation.</a> J Neurosurg. 108, 989-998 (2008).</li><li>Gill, S. S., Patel, N. K., Hotton, G. R., O'Sullivan, K., McCarter, R., Bunnage, M., Brooks, D. J., Svendsen, C. N., Heywood, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+brain+infusion+of+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+in+Parkinson+disease.">Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease.</a> Nature Medicine. 9, 589-595 (2003).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+novel+therapeutic+agents+in+tumors:+physiological+barriers+and+strategies.">Delivery of novel therapeutic agents in tumors: physiological barriers and strategies.</a> J Natl Cancer Inst. 81, 570-576 (1989).</li><li>Krauze, M. T., Saito, R., Noble, C. O., Tamas, M., Bringas, J., Park, J. W., Berger, M. S., Bankiewicz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> J Neurosurg. 103, 923-929 (2005).</li><li>Krauze, M. T., Vandenberg, S. R., Yamashita, Y., Saito, R., Forsayeth, J., Noble, C. O., Park, J. W., Bankiewicz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+real-time+convection-enhanced+delivery+of+liposomes+to+primate+brain:+a+long-term+retrospective.">Safety of real-time convection-enhanced delivery of liposomes to primate brain: a long-term retrospective.</a> Exp Neurol. 210, 638-644 (2008).</li><li>Murad, G. J., Walbridge, S., Morrison, P. F., Garmestani, K., Degen, J. W., Brechbiel, M. W., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+image-guided,+convection-enhanced+delivery+of+interleukin+13+bound+to+pseudomonas+exotoxin.">Real-time, image-guided, convection-enhanced delivery of interleukin 13 bound to pseudomonas exotoxin.</a> Clin Cancer Res. 12, 3145-3151 .</li><li>Ozawa, T., James, C. D., Van Meir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Brain+Tumor+Cell+and+Tumor+Tissue+Transplantation+Models.">Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models.</a> CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches. , 147-162 (2009).</li><li>Szerlip, N. J., Walbridge, S., Yang, L., Morrison, P. F., Degen, J. W., Jarrell, S. T., Kouri, J., Kerr, P. B., Kotin, R., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> J Neurosurg. 107, 560-567 (2007).</li><li>Yamashita, Y., Krauze, M. T., Kawaguchi, T., Noble, C. O., Drummond, D. C., Park, J. W., Bankiewicz, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+a+topoisomerase+I+inhibitor+(nanoliposomal+topotecan)+and+a+topoisomerase+II+inhibitor+(pegylated+liposomal+doxorubicin)+in+intracranial+brain+tumor+xenografts.">Convection-enhanced delivery of a topoisomerase I inhibitor (nanoliposomal topotecan) and a topoisomerase II inhibitor (pegylated liposomal doxorubicin) in intracranial brain tumor xenografts.</a> Neuro Oncol. 9, 20-28 (2007).</li></ol>

Todos os procedimentos aqui demonstrados foram aprovadas pelo Animal Care UCSF Institucional e Comitê de uso.

Avaliação pré-clínica da eficácia de qualquer agente terapêutico deve levar em conta as propriedades farmacológicas do agente e do tecido alvo de interesse. Enquanto os métodos de administração sistêmica são em geral mais fácil e melhor tolerada pelos pacientes, a seletividade da barreira hemato-encefálica, muitas vezes necessita de local de entrega da terapia para o tratamento da doença do SNC. Aqui, nós demonstramos um método de entrega direta para o cérebro: CED. Outras formas de entrega local para o cérebro incluem a administração direta com o líquido cefalorraquidiano, a injeção intratumoral bolus, e injeção ventricular. Para estes métodos, difusibilidade de terapêutica é extremamente importante, com difusão de pobres limitar a região de cobertura a alguns milímetros do local da injeção (Jain 1989, Bobo, 1994). Em contraste, CED usa pressão positiva para aumentar a área de distribuição de drogas (Bobo 1994), enquanto ainda permitindo que o alvo para terapêutica específica estruturas neuroanatômicas. Em nosso laboratório, conseguimos CED realizada no tronco cerebral, bem como para o putâmen caudado em roedores (Figura 4). A habilidade de conduzir CED em modelos de roedores tem se tornado cada vez mais importante na associação com crescente interesse em maximizar a eficácia terapêutica no tratamento de vários tipos de doença do SNC. CED pode ser usada para fornecer uma variedade de agentes, incluindo proteínas purificadas, medicamentos de pequenas moléculas e vírus (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007). A gama de doenças que podem ser tratados com CED inclui cânceres do SNC (Yamashita 2007), bem como doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson (Gill, 2003). Como a pesquisa CED continua a se expandir, a necessidade de em imagens in vivo da terapia administrada CED é igualmente crescente. Enquanto a imagem fluorescente demonstrado aqui, provavelmente não será visível através do crânio humano, outros métodos que empregam co-infusão de agentes de contraste MRI (Dickinson 2008) estão atraindo o interesse para avaliar a aplicabilidade para o monitoramento infusatos em pacientes com doença do SNC.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2% Chlorhexidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9756995</td>
<td>AKA &#x201C;Nolvasan&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>20g Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>28g Needle (with syringe)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-004-270</td>
<td>AKA Insulin Syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>3% Hydrogen Peroxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>H312P-4</td>
<td>Store away from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton Swabs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>23-400-100</td>
<td>Autoclave before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate-based Adhesive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9592632</td>
<td>AKA &#x201C;Krazy Glue&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable Scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Feather</td>
<td>2975</td>
<td>No. 21</td>
</tr>
<tr>
<td>Gauze</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22028563</td>
<td>Autoclave before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Heating Pad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dunlap</td>
<td>HP950</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I.V. Catheter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>14-841-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Infusion Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BASi</td>
<td>MD-1000, MD-1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Image Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>Contact for Quote</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmic Ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cardinal Health</td>
<td>1272830</td>
<td>AKA &#x201C;Akwa Tears&#x201D;</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic Syringe Adaptors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>P-604, P-200NX, P-215X, P-630</td>
<td>Fits on Luer Lock Syringes</td>
</tr>
<tr>
<td>Silica Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Skin Stapler, Staples, Remover</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>59020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Teflon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>1520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenogen Lumina</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>Contact for Quote</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

systemic and local drug delivery for treating diseases of the central nervous system in rodent models

Testes pré-clínicos completa do sistema nervoso central (SNC) terapêutica inclui uma reflexão sobre as vias de administração e biodistribuição agente em avaliação da eficácia terapêutica. Entre as duas principais classificações de administração, local versus sistêmica, abordagem sistêmica de entrega são muitas vezes preferido devido à facilidade de administração. No entanto, a entrega sistêmica pode resultar em concentração do fármaco suboptimal sendo alcançados no SNC, e levar a conclusões errôneas em relação à eficácia do agente. Métodos de entrega local de drogas são mais invasivos, mas pode ser necessário para atingir níveis terapêuticos CNS drogas. Aqui, demonstramos a técnica adequada para três rotas de entrega de medicamentos sistêmicos: injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, e gavagem oral. Além disso, vamos mostrar um método para entrega local para o cérebro: convecção avançada de entrega (CED). O uso de compostos fluorescentes marcado é incluído para in vivo de imagens e verificação de administração do medicamento adequado. Os métodos são apresentados usando modelos murinos, mas pode facilmente ser adaptado para uso em ratos.

Watch this Scientific Journal Video about Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models at JoVE.com

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Testes pré-clínicos completa de drogas que atuam no sistema nervoso central, muitas vezes envolve a avaliação e comparação de biodistribuição da droga em associação com rotas específicas de administração. Aqui, três métodos comumente utilizados de entrega sistêmica (intravenosa, intraperitoneal e oral), bem como um método para entrega local (convecção avançada entrega) são demonstrados em camundongos.

Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

systemic-local-drug-delivery-for-treating-diseases-central-nervous

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of Psychosis and Mania

SCIENTISTS IN ACTION

30.2K visualizações.  University of California, San Francisco - UCSF. Testes pré-clínicos completa de drogas que atuam no sistema nervoso central, muitas vezes envolve a avaliação e comparação de biodistribuição da droga em associação com rotas específicas de administração. Aqui, três métodos comumente utilizados de entrega sistêmica (intravenosa, intraperitoneal e oral), bem como um método para entrega local (convecção avançada entrega) são demonstrados em camundongos.

Vídeo: Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Neurociência

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

Uma bateria de testes informatizados para estudar os efeitos farmacodinâmicos no sistema nervoso Central de drogas colinérgicas em fase inicial de desenvolvimento de drogas

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...