서던 블로팅을 수행하려면 먼저 나일론 멤브레인을 10 x 12cm 크기의 세그먼트로 절단합니다. 젤과 같은 위치에 노치를 만드십시오. 증류수에 담근 다음 20X 구연산나트륨 완충액에 담궈 멤브레인을 활성화합니다.
이중 거꾸로 된 트레이에 여과지 심지를 놓고 끝이 외부 트레이의 바닥에 닿도록 설정합니다. 여과지 위에 젤을 놓습니다. 그런 다음 활성화된 나일론 멤브레인을 젤 위에 놓고 노치가 겹치도록 합니다.
유리 막대로 기포를 제거하십시오. 9.5 x 11.5 센티미터 크기의 셀룰로오스 여과지 2 센티미터 더미와 일반 여과지 6 센티미터 더미를 놓습니다. 동일한 가중치 분배를 위해 설정 위에 가중치를 놓습니다.
외부 트레이에 20X 구연산나트륨 완충액을 채우고 효율적인 이송을 위해 밤새 그대로 두십시오. 남부 전사 후, UV transilluminator에서 UV 가교에 의해 멤브레인에 전사 된 DNA를 고정합니다. 멤브레인을 25 밀리리터의 2X 소듐 식염수 시트레이트 완충액으로 2회 세척한다.
하이브리드화를 수행하기 위해, 멤브레인을 10 밀리리터의 예비-하이브리드화 완충액에 인큐베이션한다. 멤브레인을 자주 수동으로 부드럽게 저어줍니다. 이어서, 블롯을 섭씨 42도에서 3시간 동안 부드럽게 교반하면서 하이브리드화 완충액 10밀리리터에 인큐베이션한다.
블롯을 25 밀리리터의 엄격한 완충액으로 2회 세척하고, 실온에서 10분 동안 부드럽게 교반한다. 이제 섭씨 50도에서 15 분 동안 예열 된 엄격한 완충액 25 밀리리터에서 블롯을 두 번 씻으십시오. 실온에서 부드럽게 교반하면서 15 밀리리터의 세척 완충액으로 5 분 동안 헹굽니다.
부드럽게 교반하면서 실온에서 30 분 동안 새로 준비된 블로킹 용액 10 밀리리터에 멤브레인을 배양합니다. 그런 다음 알칼리성 포스파타제 작업 용액과 결합 된 anti-digoxigenin 10 밀리리터에 넣으십시오. 블롯을 실온에서 15분 동안 세척 완충액으로 2회 세척한다.
이제 실온에서 5 분 동안 10 밀리리터의 검출 완충액에서 배양합니다. 과량의 완충액을 제거한 후 DNA 면이 위로 향하도록 아세테이트 시트에 멤브레인을 놓습니다. 멤브레인에 약 1 내지 1.5 밀리리터의 기질 용액을 적가한다.
즉시 다른 아세테이트 시트를 그 위에 놓고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 이미징하기 전에 여분의 기질 용액을 짜내십시오. 겔 문서화 이미징 시스템을 사용하여 분석을 위해 서로 다른 시점에서 여러 개의 불포화 이미지를 수집합니다.
서던 블로팅 및 하이브리드화 후, 텔로미어 제한 단편이 도말로 표시되어 명확하게 보였습니다.
