처음에 프로토콜 최적화를 도와준 Ms. Prachi Shah에게 감사드립니다. A2780 난소암 세포주를 제공한 Manoj Garg 박사에게 감사드립니다. EK는 생명공학부(No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), 과학기술부(ECR/2018/002117) 및 NMIMS Seed Grant(IO 401405)의 연구 보조금으로 지원됩니다.

참고: 아래 프로토콜에 사용된 모든 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 표 1 은 실험실에서 만든 시약을 최적화된 부피와 함께 나열하고 표 2 는 상업적으로 이용 가능한 시약의 작동 농도를 보여줍니다.
1. 세포 배양
<ol><li>텔로미어 길이를 측정할 세포(여기서는 난소 선암 세포주인 A2780 세포)를 10% 소 태아 혈청(FBS), 스트렙토마이신, 페니실린 및 암포테리신 B가 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 완전 배지에서 6cm 페트리 접시에 유지합니다. 세포가 37%-5% 합류할 때까지 5% 이산화탄소를 포함하는 가습 및 제어된 환경에서 80°C에서 100°C에서 배양합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 5mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.</li>
	<li>세포를 37°C에서 3-5분 동안 배양하여 세포를 분리하기 위한 1 mL의 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 세포를 처리한다.</li>
	<li>DMEM 완전 배지 2mL를 추가하여 트립신을 비활성화하고 원심분리 튜브에 세포를 수집합니다.</li>
	<li>세포를 2,348 × g 에서 5 분 동안 펠렛화합니다.</li>
	<li>펠릿을 1x PBS로 세척하고 2,348 × g 에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>추가 사용이 있을 때까지 펠릿을 -80°C에서 보관하십시오. 참고: 세포 수는 세포주에 따라 다를 수 있습니다. A2780 세포주의 경우 대략 2.5 ×10 6 세포를 수득하였으며, 이는 추가 단계에서 사용된다.</li>
</ol>2. 게놈 DNA 분리
<ol><li>500μL의 용해 완충액(10mM tris-Cl, pH 8.0, 25mM EDTA, pH 8.0, 100mM NaCl, 0.5% w/v sodium dodecyl sulphate)을 세포 펠릿에 넣고 절단 팁(개구부 직경 최소 2mm)을 사용하여 부드럽게 혼합합니다. 갓 준비한 RNase A 20μg/mL를 넣고 반전으로 부드럽게 혼합합니다.</li>
	<li>37°C에서 30분 동안 배양하고 배양 중에 때때로 튜브를 뒤집습니다.</li>
	<li>프로테이나제 K를 최종 농도 100μg/mL에 첨가하고 10회 반전하여 부드럽게 혼합합니다. 55°C에서 2시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 일정한 간격(10분마다)으로 튜브를 뒤집습니다.</li>
	<li>페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 시약(25:24:1) 500μL를 넣고 20회 반전하여 부드럽게 혼합합니다. 실온(약 25°C)에서 15분 동안 9,391× g 의 원심분리기. 참고: 그림 1A 는 원심분리 후 얻은 세 개의 층을 보여줍니다.</li>
	<li>보이는 세 층 중 점성이 있는 상부 수성층을 제거하고 절단 팁을 사용하여 새 튜브에 넣고 같은 양의 클로로포름을 첨가합니다. 부드럽게 20번 뒤집어 섞어줍니다.</li>
	<li>튜브를 실온에서 9,391× g 에서 15분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>수성 층을 수집하고 NaCl의 최종 농도가 0.2M이되도록 적절한 양의 5M NaCl을 첨가합니다.</li>
	<li>100 % 에탄올 2 부피를 첨가하십시오. 부드럽게 20-25 번 섞습니다. 실온에서 5분 동안 15,871 × g 의 원심분리기.</li>
	<li>상층액을 제거하고 500 μL의 70 % 에탄올을 첨가하여 펠렛을 세척한다. 실온에서 5분 동안 15,871 × g 의 원심분리기.</li>
	<li>상층액을 제거하고, 펠릿을 몇 분 동안 자연 건조하고, 50 μL의 멸균 뉴클레아제가 없는 물을 첨가한다. DNA가 실온에서 1-2일 동안 재수화되도록 합니다. 절단 팁을 사용하여 피펫팅으로 혼합합니다.</li>
	<li>자외선(UV)-분광광도법을 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. 필요한 경우 멸균 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 샘플을 재희석하여 최소 농도 300-500ng/μL를 얻습니다.</li>
	<li>1% 아가로스 겔에서 실행하여 DNA의 무결성을 확인합니다(그림 1B).</li>
	<li>희석된 DNA를 추가 사용이 가능할 때까지 -20°C에서 보관한다.</li>
</ol>3. 게놈 DNA의 소화
<ol><li>Rsa1 (20 U) 및 Hinf1 (20 U)의 효소 혼합물을 준비하고 반응 당 2 μL의 제한 소화 완충액을 첨가한다.</li>
	<li>DNA의 총량이 1.5 μg이되도록 적절한 양의 게놈 DNA를 섭취하십시오. 뉴클레아제가 없는 멸균 물로 부피를 보충하여 효소 첨가 후 총 부피가 20μL가 되도록 합니다.</li>
	<li>두드려서 잘 섞은 다음 펄스 스핀을 합니다.</li>
	<li>혼합물을 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.</li>
</ol>4. 아가로스 겔 전기영동
<ol><li>고급 아가로스를 사용하여 1x 트리스 아세테이트 EDTA (TAE) 완충제 중의 10 cm × 15 cm 0.8% 아가로스 겔을 제조하였다.</li>
	<li>소화된 각 게놈 DNA 샘플에 로딩 염료 5μL를 추가하여 최종 부피를 25μL로 만들고 샘플을 겔에 로드합니다.</li>
	<li>1 μL의 분자 마커(ladder), 3 μL의 멸균 뉴클레아제가 없는 물 및 1 μL의 5x 로딩 염료를 사용하여 분자 마커 혼합물을 준비합니다.</li>
	<li>게놈 DNA 분해 샘플의 양쪽에 5μL의 분자 마커 믹스를 로드합니다.amples의 수가 더 많으면(~10), 또는 s가 5개 이하인 경우 한쪽에만 samples.</li>
	<li>5V/cm에서 6시간 동안 젤을 실행합니다. 실행이 완료되면 젤의 한쪽 모서리에 홈을 만들어 로딩 순서를 표시합니다.</li>
	<li>부드럽게 저어주면서 실온에서 10분 동안 0.25M HCl에 젤을 담그십시오.</li>
	<li>젤을 증류수로 두 번 헹굽니다.</li>
	<li>0.5M NaOH 및 1.5M NaCl의 용액에 겔을 부드러운 교반과 함께 실온에서 각각 15분 동안 두 번 침지하여 DNA를 변성시킵니다.</li>
	<li>젤을 증류수로 두 번 헹굽니다.</li>
	<li>0.5M tris-HCl 및 3M NaCl(pH 7.5) 용액에 겔을 2회 담가 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하여 DNA를 중화합니다.</li>
</ol>5. 서던 블로팅
<ol><li>10cm × 12cm 크기의 나일론 멤브레인을 자르고 젤과 같은 위치에 노치를 만듭니다.</li>
	<li>증류수에 담근 후 20x 시트르산나트륨(SSC) 완충액에 담궈 멤브레인을 활성화합니다( 표 1 참조).</li>
	<li>전송을 설정합니다.<ol><li>깨끗한 유리 트레이를 가져다가 다른 트레이를 거꾸로 놓습니다. 끝이 외부 트레이의 바닥에 닿도록 일반 여과지를 사용하여 심지를 만듭니다.</li>
		<li>여과지 위에 젤을 놓습니다. 노치가 겹치도록 활성화된 나일론 멤브레인을 젤 위에 부드럽게 놓고 유리 막대 위로 굴려 기포를 제거합니다.</li>
		<li>9.5cm × 11.5cm 셀룰로오스 여과지에 2cm 더미를 놓고 동일한 치수의 일반 여과지 6cm 더미를 놓습니다. 아래에 동일한 무게 분포가 있도록 이 설정 위에 무게를 놓습니다. 외부 트레이에 20x SSC 버퍼를 채웁니다( 그림 2 참조).</li>
		<li>야간 전송을 위해 설정을 그대로 둡니다.</li>
	</ol></li>
	<li>남부 전사 후, UV 트랜스 일루미네이터 또는 UV 가교제에서 UV 가교에 의해 전사 된 DNA를 멤브레인에 고정시킵니다. 302nm 8W 램프를 5분 동안 사용하거나 254nm 8W 램프를 2분 동안 사용하며, 이는 약 120mJ에 해당합니다. DNA가 전달되는 멤브레인 쪽이 램프를 향하도록 합니다.</li>
	<li>멤브레인을 25mL의 2x SSC 완충액으로 2회 세척합니다.</li>
	<li>필요한 경우 블롯을 완전히 건조시키고 호일로 느슨하게 감싼 후 추가 처리가 될 때까지 2-8°C에서 보관하여 프로토콜을 일시 중지합니다.</li>
</ol>6. 하이브리드화 및 화학발광 검출
<ol><li>프리하이브리드화 버퍼를 42°C로 예열합니다. 참고: 다음 단계에는 블롯 100cm2당 사용할 용액/완충액의 양이 포함됩니다.</li>
	<li>멤브레인을 42°C에서 1시간 동안 10mL의 프리하이브리드화 완충액에 넣고 프리하이브리드화를 위해 부드럽게 교반합니다.</li>
	<li>미리 예열된 사전 하이브리드화 버퍼 5mL당 텔로미어 프로브 0.5μL를 추가하여 하이브리드화 용액을 만듭니다.</li>
	<li>블롯을 42°C에서 3시간 동안 혼성화 용액 10 mL에서 부드러운 교반으로 인큐베이션한다.</li>
	<li>블롯을 엄격한 완충액 1(표 1)로 실온에서 10분(각각 25mL) 동안 2회 세척하고 부드럽게 교반합니다.</li>
	<li>엄격한 완충액 2(표 1)를 50°C에서 30분 동안 예열합니다.</li>
	<li>블롯을 50°C에서 15분 동안 2회(각각 25mL) 엄격한 완충액 2로 세척하고 부드럽게 교반합니다.</li>
	<li>15mL의 세척 완충액으로 RT에서 부드럽게 저어주면서 5분 동안 헹굽니다.</li>
	<li>멤브레인을 새로 준비된 1x 블로킹 용액 10mL에 넣고 실온에서 30분 동안 부드럽게 교반합니다.</li>
	<li>멤브레인을 알칼리성 포스파타제 작업 용액( 표 2 참조)과 접합된 항-디지옥시제닌 10mL에서 부드러운 교반과 함께 RT에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>블롯을 실온에서 15분 동안 세척 완충액으로 2회 세척하고 부드럽게 교반한다.</li>
	<li>10mL의 검출 완충액에서 RT에서 5분 동안 부드럽게 교반하면서 배양합니다.</li>
	<li>과잉 검출 완충액을 제거하고 DNA가 위쪽을 향하도록 멤브레인을 하이브리드화 백 또는 아세테이트 시트에 유지합니다. ~1-1.5mL의 기질 용액을 멤브레인에 적가하고 즉시 다른 시트를 그 위에 놓고 RT에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>이미징을 위해 초과 기판 용액을 짜냅니다.</li>
	<li>겔 문서화 이미징 시스템에서 약 20분 동안 블롯을 이미지화하여 서로 다른 시점에서 여러 이미지를 수집합니다. 추가 분석을 위해 불포화 이미지를 선택합니다. 알림: 신호가 약한 경우 더 오랜 시간 동안 이미징을 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 분석
<ol><li>이미지 파일을 얻은 후 가능한 최고 해상도(이 경우 600dpi)로 .tif 형식으로 게시하기 위해 내보냅니다.</li>
	<li>Telotool 소프트웨어를 설치합니다. 이를 실행하려면 특정 버전의 MATLAB(R2012a)을 무료로 사용할 수 있어야 합니다.</li>
	<li>소프트웨어를 열고 오른쪽 상단의 이미지 파일 로드 버튼을 클릭합니다.</li>
	<li>이미지를 로드한 후 이미지 반전을 클릭하여 이미지 배경이 검은색이고 얼룩/띠가 흰색이 되도록 합니다.</li>
	<li>우물에서 시작하여 상단 모서리로 이미지를 자릅니다. 자르기를 선택한 후 내부를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이미지 자르기를 선택합니다.</li>
	<li>이미지를 자른 후 차선 계산을 클릭하고 차선 감지가 자동으로 발생하도록 합니다.</li>
	<li>차선이 제대로 감지되지 않은 경우, 예를 들어 특정 차선이 전혀 감지되지 않았거나 추가 또는 일부 차선이 감지된 경우 아래 설명된 대로 차선 조정을 수행하십시오.<ol><li>Adjust Lanes(차선 조정)를 클릭하고 팝업 창이 열리면 필요에 따라 차선을 추가 및/또는 조정한 다음 Apply and Close(적용 및 닫기)를 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>차선을 조정한 후 각 차선에 빨간색 점이 표시되는지 확인하고 Ladder Fit 버튼을 사용하여 사다리를 조정하여 두 사다리 차선의 피크 수가 동일한 위치에 있는지 확인합니다. Delete Extremum 버튼을 사용하여 불필요한 피크를 제거합니다.</li>
	<li>사다리를 조정한 후 Lane Profiles(차선 프로파일)를 선택하고 Ladder Fit( 래더 맞춤)을 클릭한 다음 Polynomial Fit(다항식 맞춤)을 선택합니다.</li>
	<li>소프트웨어에서 권장하는 대로 Trendline(추세선)을 클릭한 후 다음 옵션에서 Corrected(수정됨 )를 선택합니다.</li>
	<li>Get Results(결과 가져오기)를 클릭하여 결과를 테이블로 표시하며, 여기서 Mean TRF 행은 각 레인 샘플의 텔로미어 길이 측정값입니다.</li>
	<li>모두 저장을 클릭하여 결과를 스프레드시트 형식으로 저장합니다.</li>
</ol>

Non-Radioactive Chemiluminescence Detection을 사용한 텔로미어 길이 정량화

<ol>
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저자는 이해 상충이 없습니다.

서던 블로팅(Southern blotting)을 사용하여 텔로미어 길이를 측정하기 위한 비방사성 화학발광 기반 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 결과의 품질에 대한 타협 없이 여러 시약을 현명하게 사용할 수 있도록 테스트되었습니다. 프리하이브리드화 및 하이브리드화 버퍼는 최대 5회까지 재사용할 수 있습니다. 효소 농도는 결과에 영향을 미치지 않고 게놈 DNA 1.5-2 μg 당 10-20 U 사이에...

텔로미어는 염색체 끝에 존재하는 반복적인 DNA 서열입니다. 그들은 TTAGGG의 탠덤 반복을 가지고 있으며 염색체를 닳아 없어지고 말단 복제 문제로부터 보호함으로써 게놈 무결성을 유지하는데, 이는 3' 돌출부의 일부가 DNA 중합효소 1,2에 의해 복제될 수 없음을 의미합니다. 짧은 텔로미어는 세포에서 염색체 이상을 일으키며, 이로 인해 세포는 복제 노화3이라는 단계에서 영구적으로 정지됩니다. 짧은 텔로미어는 또한 미토콘드리아 기능 장애 4,5 및 세포 기능 장애와 같은 다른 많은 문제를 일으킵니다.
DNA 텔로미어 반복은 세포가 분열할 때 소실되며, 매년 평균 25-200 bp의 손실이 발생하며6, 일정 수의 분열 후에 세포 노화가 일어난다6. 노화는 더 높은 빈도의 동반 질환과 관련이 있으며, 이는 텔로미어 길이가 짧아지는 것을 특징으로 한다7. 텔로미어 제한 단편(Telomere restriction fragment, TRF) 분석은, 멘더(Mender)에 의해 기술된 바와 같이, 매우 비용이 많이 드는 방법이다8. 이 때문에 대부분의 연구에서 텔로미어 길이를 정량화하는 동안 구현되지 않습니다.
현재 대부분의 역학 연구는 텔로미어 길이의 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 기반 측정을 사용합니다. 그러나 qPCR 기반 방법은 절대 텔로미어 길이가 아닌 텔로미어와 단일 복제 유전자 증폭 산물 간의 비율을 측정하기 때문에 상대적인 측정 방법입니다. TRF 프로토콜을 사용한 텔로미어 길이 측정은 샘플의 텔로미어 길이 분포를 측정할 수 있고 측정값을 킬로베이스(kb) 단위의 절대값으로 표현할 수 있기 때문에 황금 표준 방법입니다. 그러나 번거롭고 노동 집약적이며 비용이 많이 들기 때문에 사용이 제한적입니다. 여기에서는 화학발광 기반 TRF를 사용한 텔로미어 길이 측정에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.
TRF 분석에는 1) 게놈 DNA 추출을 위한 세포 배양, 2) 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(P:C:I) 방법을 사용한 게놈 DNA 추출, 3) 게놈 DNA의 제한 소화, 4) 아가로스 겔 전기영동, 5) 제한 소화 DNA 단편의 서던 블랏팅, 6) 하이브리드화 및 검출을 통한 7가지 주요 단계가 포함됩니다 화학발광 - 고정된 텔로미어 프로브는 알칼리성 포스파타제에 대한 고감도 화학발광 기질인 디소듐 2-클로로-5-(4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2′-(5-클로로트리사이클로[3.3.1.13.7]데칸])-4-일]-1-페닐 포스페이트(CDP-Star)-및 7) 이러한 텔로미어 도말로부터 평균 텔로미어 길이 및 범위 정보를 얻기 위한 분석.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)</td>
			<td>Received as a gift</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Universal hood II (721BR14277)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop (Epoch 2)</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeloTool</td>
			<td>Version 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP</td>
			<td>180720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>HyClone, Cytiva, USA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI FBS</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>76-47-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11209299001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE healthcare lifesciences</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15557-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti DIG AP</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution 10x</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection buffer 10x</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dig easy hyb</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hinf 1</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hinf 1 (alternative to kit)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0155T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td>BIOLABS</td>
			<td>N3231S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid buffer 10x</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular marker</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rsa 1</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rsa 1 (alternative to kit)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0167L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of performance parameters of the taggg telomere length assay

텔로미어는 염색체 말단에 존재하는 반복적인 서열입니다. 그들의 단축은 인간 체세포의 특징입니다. 단축은 말단 복제 문제와 텔로미어 길이 유지를 담당하는 텔로머라아제 효소의 부재로 인해 발생합니다. 흥미롭게도 텔로미어는 산화 스트레스 및 염증과 같은 다양한 내부 생리학적 과정에 대한 반응으로 짧아지며, 이는 오염 물질, 감염원, 영양소 또는 방사선과 같은 세포 외 물질로 인해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 텔로미어 길이는 노화 및 다양한 생리적 건강 매개변수의 우수한 바이오마커 역할을 합니다. TAGGG 텔로미어 길이 분석 키트는 텔로미어 제한 단편(TRF) 분석을 사용하여 평균 텔로미어 길이를 정량화하는 데 사용되며 재현성이 높습니다. 그러나 비용이 많이 드는 방법이며 이 때문에 많은 수의 샘플에 일상적으로 사용되지 않습니다. 여기에서는 서던 블롯 또는 TRF 분석 및 비방사성 화학발광 기반 검출을 사용하여 텔로미어 길이를 최적화하고 비용 효율적으로 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

Telomeres are the repetitive DNA sequences present at the end of chromosomes. They have tandem repeats of TTAGGG and maintain genome integrity by protecting the chromosome from both fraying and the end replication problem, which means that part of the 3&#39; overhang is unable to be replicated by DNA polymerase1,2. Short telomeres lead to chromosomal abnormalities in cells, due to which cells become permanently arrested in a stage called replicative senescence3. Short telomeres also cause a host of other problems, such as mitochondria dysfunction4,5 and cell dysfunction.
DNA telomeric repeats are lost as and when the cell divides, with an average loss of 25 to 200 bp per year6, resulting in cellular senescence after a certain number of divisions6. Aging is associated with a higher frequency of comorbidities, which is marked by a shortening in telomere length7. Telomere restriction fragment (TRF) analysis, as described by Mender, is a very expensive method8. Because of this, it is not implemented while quantifying telomere length in most studies.
Presently, the majority of epidemiological studies employ quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based measurements of telomere length. However, the qPCR-based method is a relative measurement method, as it measures the ratio between telomeres and single-copy gene amplification products, and not absolute telomere length. Telomere length measurement using the TRF protocol is the gold standard method, as it can measure telomere length distribution in the sample and measurements can be expressed in absolute values in kilobases (kb). However, its use is limited because it is cumbersome, labor-intensive, and costly. Here, we present an optimized protocol for telomere length measurement using chemiluminescence-based TRFs.
TRF analysis includes seven major steps: 1) culturing of cells for genomic DNA extraction, 2) genomic DNA extraction using the phenol:chloroform:isoamylalcohol (P:C:I) method, 3) restriction digestion of genomic DNA, 4) agarose gel electrophoresis, 5) Southern blotting of the restriction digestion DNA fragment, 6) hybridization and detection via chemiluminescence-the immobilized telomere probe is visualized by a highly sensitive chemiluminescent substrate for alkaline phosphatase, disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-phenyl phosphate (CDP-Star)-and 7) analysis for obtaining mean telomere length and range information from these telomeric smears.

저자 스포트라이트: TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 파라미터 최적화  

TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 매개변수 최적화

The scope of our research involves measuring telomere length differences across various study groups. The questions we are trying to answer revolve around diseases of physiological conditions and how they may affect telomere length and vice versa. The technology is currently used to advance research in the field of telomere length biology are nanopore sequencing and more recently CRISPR Cas based measurement.Current experimental challenges are accurately measuring absolute telomere length and the changes in it. The same sample could give varying results when different methods of measuring telomere length are used. The research gap we address is the lack of a standard method to measure telomere length.Telomere restriction fragment analysis or TRF, is still the standard against which all new techniques are evaluated. Also, our optimized protocols helps in processing a higher number of samples with limited resources. Our findings will help advance research in the field of telomere length biologic by providing a reliable and relatively economical way to compare newer methods to the gold standard, which is TRF.Our laboratory will focus on the effects of small molecule inhibitors on telomere length. We will also study the impact that lifestyle diseases and telomere length have on on each other.

1% 아가로스 겔 상에서 실행된 추출된 게놈 DNA(gDNA)는 그림 1B에 표시된 바와 같이 우수한 무결성을 나타내었으며, 이는 샘플이 TRF의 추가 다운스트림 처리에 사용될 수 있음을 나타냅니다. 이어서, TRF 분석은 각 단계에서 요구되는 용액의 부피를 변형시킴으로써 수행되었다(표 1 및 표 2 참조). TRF 신호가 선명하게 보였습니다(그림 3</st...

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여기에서는 완충액 양 및 프로브 농도와 같은 TAGGG 텔로미어 길이 분석 키트의 다양한 성능 매개변수 최적화에 중점을 두고 비방사성 화학발광 검출을 사용하여 텔로미어 길이를 정량화하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

우리 연구의 범위는 다양한 연구 그룹에서 텔로미어 길이 차이를 측정하는 것입니다. 우리가 대답하려는 질문은 생리적 조건의 질병과 그것이 텔로미어 길이에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지, 그리고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 이 기술은 현재 텔로미어 길이 생물학 분야의 연구를 발전시키는 데 사용되며, 나노 포어 시퀀싱과 최근에는 CRISPR Cas 기반 측정이 있습니다.현재의 실험 과제는 절대 텔로미어 길이와 그 변화를 정확하게 측정하는 것입니다. 텔로미어 길이를 측정하는 다른 방법을 사용할 때 동일한 샘플이 다양한 결과를 제공할 수 있습니다. 우리가 다루는 연구 격차는 텔로미어 길이를 측정하는 표준 방법이 없다는 것입니다.텔로미어 제한 단편 분석 또는 TRF는 여전히 모든 새로운 기술을 평가하는 표준입니다. 또한 최적화된 프로토콜은 제한된 리소스로 더 많은 수의 샘플을 처리하는 데 도움이 됩니다. 우리의 연구 결과는 새로운 방법을 금본위제인 TRF와 비교할 수 있는 신뢰할 수 있고 비교적 경제적인 방법을 제공함으로써 텔로미어 길이 생물학적 제제 분야의 연구를 발전시키는 데 도움이 될 것입니다.우리 실험실은 텔로미어 길이에 대한 소분자 억제제의 효과에 초점을 맞출 것입니다. 우리는 또한 생활 습관병과 텔로미어 길이가 서로에게 미치는 영향을 연구할 것입니다.

optimization-performance-parameters-taggg-telomere-length

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

1.5K 조회수.  SVKM's NMIMS Deemed-to-be-University. 우리 연구의 범위는 다양한 연구 그룹에서 텔로미어 길이 차이를 측정하는 것입니다. 우리가 대답하려는 질문은 생리적 조건의 질병과 그것이 텔로미어 길이에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지, 그리고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 이 기술은 현재 텔로미어 길이 생물학 분야의 연구를 발전시키는 데 사용되며, 나노 포어 시퀀싱과 최근에는 CRISPR Cas 기반 측정이 있습니다...

비디오: 저자 스포트라이트: TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 파라미터 최적화  

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

연구

암 연구학

A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis

Begin by adding 500 microliters of the lysis buffer to the previously obtained A2780 cell pellet, and mix gently using a cut tip with a minimum opening diameter of two millimeters. Add 20 micrograms per milliliter of freshly prepared RNase and mix by gentle inversion. Incubate it at 37 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of incubation, add proteinase K to a final concentration of 100 micrograms per milliliter and gently invert 10 times. Incubate again at 55 degrees Celsius for one hour inverting the tube every 10 minutes. Pipette 500 microliters of phenol:chloroform:isoamyl alcohol reagent into the tube and gently invert the tube about 20 times.Centrifuge it at 9, 391 G for 15 minutes at room temperature. Pipette the upper aqueous viscous layer into a new tube. Add an equal volume of chloroform and mix by gentle inversion.After centrifuging the tube once, collect the aqueous layer. Add an appropriate amount of five molar sodium chloride in the tube to increase the concentration by 0.2 moles. Add two volumes of 100%ethanol into the tube and invert it gently 20 times.Centrifuge at 15, 871 G for five minutes at room temperature. After discarding the supernatant, add 500 microliters of 70%ethanol. Centrifuge again at the same condition and then discard the supernatant.Once the pellet is air dried, add 50 microliters of sterile nuclease free water and let it rehydrate. Then mix the DNA by pipetting using the cut tip. Use UV spectrophotometry to measure the concentration of DNA.After digesting the DNA, separate it using 0.8%agarose. Submerge the agarose gel in 0.25 molar hydrochloric acid solution for 10 minutes at room temperature with gentle agitation. Then rinse the gel twice with distilled water.To denature the DNA, submerge the gel in a solution of sodium hydroxide and sodium chloride. Then rinse the gel twice with distilled water. To neutralize the DNA as demonstrated, submerge the gel in a solution of 0.5 molar hydrochloric acid and three molar sodium chloride at pH seven.The extractor genomic DNA showed good integrity indicating its use for further downstream processing of telomere restriction fragments.

A2780 세포 게놈 DNA 분리 및 분석

Southern Blotting, Hybridization, and Chemiluminescence Detection of Genomic DNA Isolated from A2780 Cells

To perform southern blotting, start by cutting a nylon membrane into a 10 by 12 centimeter sized segment. Make a notch in the same position as the gel. Activate the membrane by dipping it in distilled water, followed by 20X sodium saline citrate buffer.Place a filter paper wick on a double inverted tray, set such that the ends touch the base of the outer tray. Place the gel over the filter paper. Then place the activated nylon membrane over the gel, ensuring that the notches overlap.Remove any air bubbles with a glass rod. Place a two centimeter heap of 9.5 by 11.5 centimeter sized cellulose filter paper, and another six centimeter heap of regular filter paper. Place a weight atop the setup for equal weight distribution.Fill the outer tray with 20X sodium saline citrate buffer, and leave it overnight for efficient transfer. After southern transfer, fix the transferred DNA on the membrane by UV crosslinking on a UV transilluminator. Wash the membrane twice with 25 milliliters of 2X sodium saline citrate buffer.To perform hybridization, incubate the membrane in 10 milliliters of the pre-warmed pre-hybridization buffer. Gently agitate the membrane manually at frequent intervals. Then incubate the blot in 10 milliliters of hybridization buffer at 42 degrees Celsius for three hours with gentle agitation.Wash the blot twice in 25 milliliters of stringent buffer for 10 minutes at room temperature with gentle agitation. Now wash the blot twice in 25 milliliters of pre-warmed stringent buffer at 50 degrees Celsius for 15 minutes with gentle agitation. Rinse with 15 milliliters of wash buffer for five minutes with gentle agitation at room temperature.Incubate the membrane in 10 milliliters of freshly prepared blocking solution for 30 minutes at room temperature with gentle agitation. Then place it in 10 milliliters of anti-digoxigenin conjugated with an alkaline phosphatase working solution. Wash the blot twice in the wash buffer at room temperature for 15 minutes.Now incubate in 10 milliliters of detection buffer for five minutes at room temperature. After removing the excess buffer, place the membrane on an acetate sheet with the DNA side facing up. Add approximately one to 1.5 milliliters of substrate solution dropwise on the membrane.Immediately place another acetate sheet on it and incubate for five minutes at room temperature. Squeeze out the excess substrate solution before imaging. Using a gel documentation imaging system, collect multiple unsaturated images at different time points for analysis.After southern blotting and hybridization, the telomere restriction fragments were clearly visible, indicated by a smear.

A2780 세포에서 분리된 게놈 DNA의 Southern Blotting, Hybridization, and Chemiluminescence Detection of Genomic DNA Isolation (A2780 세포에서 분리된 게놈 DNA의 Southern Blotting, Hybridization, and Chemiluminescence Detection)