대두 자엽을 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)로 감염시키기 위해, 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes) PRI2659 플라스미드의 서열을 이용하여 TI 플라스미드 유전자 virD2를 검출하는 프라이머를 디자인한다. 형질전환 후, PCR 키트를 사용하여 PCR에 의해 virD2의 보유에 대해 아그로박테리움 콜로니를 시험한다. virD2와 관심 유전자를 모두 포함하는 아그로박테리움 리조제네스 콜로니를 선택한 후, 관심 플라스미드에 대해 리터당 100mg의 스펙티노마이신을 함유하는 LB 플레이트에 일부 콜로니를 줄무늬로 만듭니다.
다음날, P200 피펫 팁을 사용하여 LB 플레이트에서 1.5cm 길이의 아그로박테리움을 긁어내고 1밀리리터의 인산염 완충액에 재현탁합니다. 재현탁된 세포 현탁액과 멸균된 초순수를 아세토시링곤에 희석합니다. 큐벳 튜브를 사용하여 600 나노미터의 광학 밀도로 흡광도를 측정합니다.
다음으로, 생물 안전 캐비닛에서 멸균 된 메스를 아그로박테리움 용액에 담그고 자엽의 내부 표면을 따라 1 밀리미터 깊이로 자릅니다. 6-8 개의 자엽을 발아로 포화 된 여과지와 아세토 시링 곤으로 재배 배지가 들어있는 페트리 접시에 놓습니다. 플레이트를 실온에서 3일 동안 16시간의 사진 기간 하에 인큐베이션한다.
3 일 후, 감염된 자엽을 털이 많은 뿌리 성장 또는 HRG 플레이트로 옮깁니다. 섭씨 22도로 설정된 성장 챔버에서 플레이트를 16시간 동안 1차 뿌리와 2차 뿌리 길이가 2-3센티미터인 1차 뿌리가 관찰될 때까지 16시간 동안 광도에서 100마이크로몰의 광도를 배양합니다. 3-4 주 후, 굳은 살에서 자라는 1 차 뿌리를 수확하고 멸균 메스와 집게를 사용하여 2 차 뿌리를 포함합니다.
뿌리를 적절한 항생제가 들어있는 HRG 플레이트로 옮기고 추가로 5 일 동안 자랄 수 있도록합니다. 5 일째에는 길이가 3-6 센티미터 인 2 차 뿌리를 가진 형질 전환 털이 많은 뿌리를 수확합니다. 형광 단백질을 관찰하는 경우 2차 뿌리에 자가형광이 거의 없는지 확인하십시오.
다음으로, 유도 또는 화학 처리를 수행하기 위해 2 차 뿌리를 1 센티미터 조각으로 자르고 HRG 한천에 약 100 밀리그램을 더미에 놓습니다. 그런 다음 80 마이크로 리터의 적절한 처리 용액으로 더미를 포화시키고 플레이트를 실온에서 배양합니다. 24시간 후, RNA 추출을 위해 멸균된 종이 타월로 뿌리를 빠르게 두드려 건조시키고 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 직접 수확합니다.
파라 필름을 사용하여 튜브의 상단을 즉시 밀봉하고 뾰족한 집게를 사용하여 두 개의 작은 구멍을 만듭니다. 형질전환된 아그로박테리움의 콜로니 PCR 결과를 나타내었다. PCR에서 양성 콜로니는 관심 유전자를 나타냅니다.
그러나, 콜로니의 1/3 내지 1/2은 virD2 유전자 스크리닝에 대해 음성이었다. 형광 현미경은 GFP-GmJAZ1-6의 세포 내 국소화를 보여줍니다. 유전자 발현 분석은 윌리엄스 82 해리 뿌리에서 글리세올린 전사 인자 GmHSF6-1 및 GmMYB2912의 RNAi 침묵의 과발현을 확인하였다.
