Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation

시작하려면 글리세롤 스톡의 Limosilactobacillus reuteri DSM20016를 50 밀리리터 튜브에 6 밀리리터의 De Man, Rogosa, Sharpe 또는 MRS 국물에 접종하십시오. 정적 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 호기성으로 배양합니다. 다음날, 하룻밤 배양액 4 밀리리터를 MRS 국물 200 밀리리터에 접종한다.

600 나노 미터의 광학 밀도가 0.5에서 0.85에 도달 할 때까지 정적 섭씨 37도 인큐베이터에서 배양 물이 호기성으로 성장하도록합니다. 다음으로, 배양액을 50밀리리터 원심분리기 튜브에 디캔팅하고 튜브의 균형을 맞추면서 얼음 위에 놓습니다. 미리 냉각된 원심분리기에서 배양액을 원심분리하고 상층액을 버립니다.

펠릿을 50 밀리리터의 미리 냉장 된 이중 증류수에 재현 탁하기 전에 원심 분리를 두 번 반복하십시오. 마지막 원심분리 후, 펠릿을 25밀리리터의 이중 증류수, 0.5몰 자당 및 10% 글리세롤에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 상층액을 버리고, 얼음 위의 이중 증류수 2밀리리터, 0.5몰 자당 및 10% 글리세롤에 펠릿을 재현탁합니다.

현탁액을 미리 냉장된 미세 원심분리기 튜브에 50-100마이크로리터 부분으로 분취하고 나중에 사용할 수 있도록 튜브를 섭씨 영하 80도에 보관합니다. 다음으로, 전기천공을 위해, 전기적격 전지의 분취량을 얼음 위에서 해동한다. 5 내지 10 마이크로리터의 플라스미드를 해동된 분취량에 혼합하되, 가능한 한 피펫팅을 피한다.

혼합물을 얼음으로 식힌 1밀리리터 갭 전기천공 큐벳으로 옮기고 1.25킬로볼트, 400옴 및 25마이크로패럿에서 전기증착합니다. 전기 천공 후 MRS 국물 1밀리리터를 넣고 큐벳을 한두 번 뒤집어 섞습니다. 큐벳을 섭씨 37도의 정적 인큐베이터에 2.5-3시간 동안 넣어 회복합니다.

다음으로, 적절한 선택을 통해 전체 현탁액을 여러 MRS 오거 플레이트에 플레이트합니다. 향 주머니를 생성하는 혐기성 분위기에서 작은 불이 켜진 양초가 있는 밀폐 용기 안에 접시를 놓습니다. 섭씨 37도에서 2-3 일 동안 또는 눈에 보이는 식민지가 나타날 때까지 자랍니다.

pTRKH3 플라스미드를 생산하는 구성적 mCherry2를 사용한 L.reuteri의 전기천공법은 플라스미드 메틸화 조건에 관계없이 도금된 200마이크로리터당 약 5-8개의 콜로니의 형질전환 효율을 제공합니다. 외인성 구성 리포터 단백질을 운반하지 않는 pNZ123을 사용한 형질전환은 DNA 마이크로그램당 4CFU의 3배 10의 형질전환 효율을 산출했습니다.