융합 단백질의 아미노 말단에서 소포 핵 형성 펩타이드 또는 VNP 서열 태그를 클로닝한 후 섭씨 37도에서 포화 상태까지 신선한 박테리아 형질전환에서 5밀리리터 용원 배양액 또는 LB 스타터를 배양합니다. 그런 다음 500밀리리터의 원뿔형 플라스크에 적절한 항생제 선택이 포함된 훌륭한 국물 또는 TB 25밀리리터를 접종하는 데 사용합니다. 배양물이 0.8 내지 1.0의 600 나노미터 광학 밀도 값, 또는 OD600에 도달할 때까지 분당 200회 회전 또는 25mm 궤도 던지기와 같은 속도로 흔들면서 섭씨 37도의 인큐베이터에서 플라스크를 배양합니다.
이어서, 밀리리터당 최대 20 마이크로그램 또는 84 마이크로몰의 최종 농도에 IPTG를 첨가하여 T7 프로모터로부터 재조합 단백질 발현을 유도한다. 유도를 위한 충분한 시간을 허용한 후, 섭씨 4도에서 3000G에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 멸균 및 세제가 없는 0.45미크론 PES 필터에 통과시켜 장기 보관을 위해 배지가 포함된 소포를 멸균합니다.
소포를 더 작은 부피로 농축하려면 배지가 포함된 멸균 소포를 멸균 및 세제가 없는 0.1미크론 MCE 필터를 통과시킵니다. 그런 다음 0.5-1 밀리리터의 멸균 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 멤브레인을 부드럽게 세척하고 세포 스크레이퍼 또는 플라스틱 스프레더를 사용하여 멤브레인에서 소포를 조심스럽게 제거합니다. 피펫을 사용하여 소포 농축액을 신선한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
정제 된 소포는 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. 소포 지질막을 파괴하고 단백질을 방출하기 위해 적절한 일정을 사용하여 멸균 배지에서 소포를 포함하는 단백질을 초음파 처리합니다. 초음파 처리 된 현탁액을 39, 000 G 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리하여 소포 파편을 제거합니다.
VNp6-mNeongreen 발현 구조체를 포함하는 대장균BL21DE3 IPTG로 밤새 유도되는 mNeongreen 형광을 나타냈습니다. 형광은 원심분리에 의해 박테리아 세포를 제거한 후 배양물에서 볼 수 있는 상태로 유지되었습니다. 투명화된 배양 배지에서 배양 내 VNp-mNeongreen의 존재는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인되었습니다.
PBS에 재현탁된 정제된 소포도 형광을 나타냈다.
