시작하려면 안락사된 쥐를 복부 쪽이 위로 향하게 하여 해부면에 놓습니다. 멸균 집게로 피부층을 꼬집고 표면 높이를 절단하여 내부 장기의 손상을 방지합니다. 크고 날카로운 해부 가위를 사용하여 복부 중앙을 세로로 자릅니다.
그런 다음 해당 절단에서 시작하여 양쪽에 하나씩 두 개의 더 짧은 수평 절단을 만듭니다. 집게를 사용하여 피부를 벗겨내어 복강을 노출시킵니다. 복막(peritoneal membrane)을 절단하여 복강의 내부 장기를 완전히 노출시켜 장에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
가위와 집게를 사용하여 위의 위치를 파악하고 약 2-3cm 떨어진 곳에 노란색 분절로 보이는 십이지장을 확인합니다. 근위 jejunum은 Treitz의 인대에서 약 4-5cm 떨어진 곳에 위치합니다. 십이지장과 제주눔 사이의 랜드마크.
분리된 장 조각을 10cm 페트리 접시에 담습니다. 장간막의 원하는 장 부분을 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 내강 내용물이 제거될 때까지 씻어냅니다. 종이 타월에 장 부분을 2cm 길이로 자릅니다.
그런 다음 각 장 조각을 세로로 열어 상피를 노출시킵니다. 유리 현미경 슬라이드를 사용하여 노출된 내강 표면을 긁어 융모를 제거합니다. 장 조각을 얼음 위의 EDTA 용액에 넣고 10RPM으로 설정된 튜브 리볼버에서 30분 동안 섭씨 4도 회전시킵니다.
해부 현미경에서 튜브의 내용물을 10cm 페트리 접시에 붓습니다. 얼음처럼 차가운 PBS 5밀리리터를 추가로 추가합니다. 미세한 집게를 사용하여 장 분절을 잡고 세게 흔들어 상피가 PBS로 방출되는 것을 관찰합니다.
처음에 PBS에는 대부분 융모가 포함됩니다. 장 조각을 계속 흔들고, 융모가 포함된 PBS를 주기적으로 버리고, 장 조각에 신선한 PBS 10mL를 추가합니다. 조각을 계속 흔들고 융모가 더 이상 PBS로 방출되지 않을 때까지 PBS 세척 단계를 반복합니다.
그러나 대신 PBS에는 주로 암호화가 포함되어 있습니다. 남은 장 조각을 버리고 장 토막화를 위해 페트리 접시에 남아 있는 PBS를 농축합니다. 조직 배양 후드에서 PBS가 포함된 크립트를 수집하고 70미크론 세포 배수기를 통해 필터링합니다.
여과액을 250 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 펠릿을 5mm 고급 DMEM 플러스에 재현탁시킵니다. 250 x g에서 다시 5분간 원심분리합니다.
그리고 상층액을 제거하고 펠릿과 함께 50 마이크로 리터의 매체를 남깁니다. 펠릿을 나머지 배지에 재현탁시키고 얼음 위의 세포외 기질 추출물 또는 EME의 부분 표본에 첨가합니다. 거품이 생기지 않도록 EME 전체에 크립트를 고르게 매달기 위해 위아래로 부드럽게 피핑합니다.
50 마이크로 리터의 EME 돔을 35 밀리미터 조직 배양 접시에 넣습니다. 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 20분 동안 배양했습니다. 배양 후 Y27632 및 CHIR99021 각각 10마이크로몰을 포함하는 2밀리리터의 쥐 장 오가노이드 배지(RIOM)를 추가합니다.
다음으로, 쥐의 장 오가노이드를 통과시키기 위해 오가노이드가 포함된 플레이트에서 배지를 흡인하고 1밀리리터의 해리 시약을 추가하여 EME 돔에서 오가노이드를 방출합니다. 조각난 오가노이드가 있는 해리 시약을 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 2mL의 고급 DMEM plus로 배양 플레이트를 세척하고 조각난 오가노이드가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 추가합니다.
유리 목초지 피펫을 사용하여 15-20회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 오가노이드를 조각냅니다. 오가노이드를 350 x g에서 2분 동안 원심분리하고 튜브 바닥에서 EME로 50마이크로리터의 용액을 추가합니다. 용액을 혼합한 후 50마이크로리터의 EME 돔을 35mm 조직 배양 접시에 담고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 20분 동안 배양합니다.
배양 후 Y27632 및 CHIR99021 각각 10마이크로몰을 포함하는 2mL의 RIOM을 추가합니다. 융모 조각과 토굴의 대표 이미지가 표시됩니다. 크립트는 융모에 비해 크기가 작습니다.
도금된 크립트는 다음 며칠 동안 확장되고 4일에서 7일까지 싹을 틔우고 분화하기 시작합니다. 이틀 동안 해동한 후 건강한 오가노이드 배양은 스페로이드와 발아된 오가노이드의 존재를 모두 보여주었습니다. passaging 후 동일한 오가노이드 라인은 단일 crypt-like 도메인의 존재를 보여주었습니다.
