Generation of Rat Intestinal 2D Monolayers from 3D Organoids

플레이트를 EME로 코팅하려면 EME 1에서 20을 저온 고급 DMEM+콜라겐 코팅의 경우 고급 DMEM+에서 콜라겐 I의 밀리리터당 5밀리그램을 밀리리터당 100마이크로그램으로 희석합니다. 200 마이크로 리터의 희석 된 EME 또는 콜라겐으로 플레이트를 코팅하여 우물 표면을 완전히 덮고 섭씨 37도에서 1-2 시간 동안 배양합니다. 단층을 생성하려면 오가노이드가 포함된 35mm 플레이트에서 매체를 흡입합니다.

PBS 1밀리리터를 추가하고 P1000 팁으로 웰의 EME를 파괴하고 약 20회 위아래로 피펫팅하여 모든 EME를 풉니다. 내용물을 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 플레이트에 PBS 1밀리리터를 추가하여 추가 오가노이드를 수집하고 동일한 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

샘플을 350G에서 2분 동안 원심분리하고 EME 잔류물을 포함한 상층액을 제거합니다. 그런 다음 오가노이드 펠릿에 트립신 용액 1m리터를 넣고 섭씨 37도에서 2분 동안 배양합니다. P1000 팁을 사용하여 위아래로 10회 피펫팅하고 2mL의 Advanced DMEM+를 추가하여 트립신을 중화합니다.

350G에서 5분 동안 원심분리하고 4.8ml의 rIOM2D에 펠릿을 재현탁하기 전에 상층을 흡인합니다. 웰에서 Advanced DMEM+의 과도한 EME 또는 콜라겐을 제거합니다. 그런 다음 rIOM2D에 200마이크로리터의 오가노이드와 10마이크로몰 Y27632를 사전 코팅된 각 웰에 추가합니다.

4 16 시간 후에, 1 의 1 분 동안 000 G에 매체 및 분리기를 모으십시오. 상층액을 새 15밀리리터 원뿔형 튜브에 옮기고 펠릿을 버립니다. 각 웰에 원심분리된 rIOM200D를 추가하기 전에 300마이크로리터의 PBS로 각 웰을 세척합니다.

2-3일마다 rIOM2D를 교체하고, EME를 세포 상단에 다시 추가할 때 EME에 도금된 Y27632.2D 단층이 작은 스페로이드로 쉽게 재형성되는 것을 중단합니다. 대조적으로, 콜라겐 I 기질은 3D 구조를 개질하기에 충분하지 않았습니다.