우리는이 원고의 중요한 읽기 위해 부인과 종양학 그룹의 구성원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 부분적으로 국립 보건 의료 연구위원회, 호주 연구위원회, 그리고 암 연구소 NSW (PST)에서 자금을 지원합니다. MK 뉴캐슬 대학원 연구 활동의 대학을받는 사람입니다.

동물 관리 및 실험 절차는 뉴 사우스 웨일즈 동물 연구 법, 뉴 사우스 웨일즈 동물 연구 규제 및 관리를위한 호주 코드와 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행하고 확인 하였다 과학적 목적을 위해 동물의 사용합니다. 마우스에 착수 모든 절차는 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1 시간 짝짓기 <ol><li> 쌍 6~8주 세 남성 및 일광 사이클이 종료 직전 암컷 마우스. </li><li> 질 플러그의 존재 이른 아침 (또는 8.00 이전 AM), 매일 매일 암컷을 확인합니다. 플러그의 날 0.5 DPC로 간주됩니다. </li><li> (남성)없이 새로운 케이지에 질 플러그 여성을 전송하고 플러그의 날짜를 레이블을 붙입니다. </li></ol> 마우스 배아 생식소 능선 2. 분리 <ol><li> 마우스 embryon을 분리후술하는 바와 같이 15.5 DPC 임신 여성에서 생식기 IC 리지는 약간의 수정 9에 기재된 바와 같이. </li><li> 임신 한 여성이 오후에 의한 임신의 다음날에 들어갈 것으로 간주하는 시간으로 정오 전에 절개를 수행합니다. </li><li> 자궁 경부 전위를 사용하여 15.5 DPC 임신 여성을 희생 (또는 기관의 동물 윤리위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라). </li><li> 흡수성 티슈 페이퍼에 그 뒷면에 마우스를 유지하고 70 % 에탄올로 복부의 복부 측면을 스프레이. </li><li> 흉곽에 끝까지 비뇨 생식기 개구부로부터 연장, 집게와 하복부 피부 (복부 쪽)을 들어 올려 수술 가위를 사용하여 횡 절개를합니다. 복부를 노출 동물의 머리를 향해 피부를 당겨. </li><li> 복강을 노출 수술 가위로 복부 근육을 잘라. 바로 자궁 경부 위의 집게로 임신하는 자궁을 잡고 상처를합니다. 이제 t에 개최하여 자궁을 들어 올려오 방광 및 복막 첨부 파일에서 자궁를 분리하기 - 자궁 접합에서 삭감 다음에 자궁 넓은 인대를 잘라. </li><li> 빙냉 HBSS (행크 균형 염 용액)을 함유하는 50 ㎖ 튜브에 자궁 옮긴다. 여분의 혈액을 제거하는 얼음처럼 차가운 HBSS로 부드럽게 임신하는 자궁을 씻으십시오. </li><li> 빙냉 HBSS를 함유하는 페트리 접시에 자궁 유지하고 얼음에 유지한다. 자궁 벽을 잘라 배아를 꺼내. 얼음에 HBSS와 신선한 페트리 접시에 배아를 유지합니다. </li><li> 깨끗한 살균 티슈 페이퍼를 가지고 새로운 배양 접시에 넣어. 티슈 페이퍼에 70 % 에탄올을 분무. 측면에서이 조직 종이에 배아를 유지하고 그림 1에서 점선으로 나타낸 바와 같이 방향 멸균 블레이드를 사용하여 하복부에서 잘라. </li><li> 척추를 고정하여 멸균 스폰지베이스의 배아를 수정합니다. </li><li> 해부 실체 현미경 아래로 놓고 조심스럽게 복부 정중선을 따라 절단. 간과 창자를 제거합니다. 마우스 비뇨 생식기 시스템 (신장, 요관, 고환, WD 및 정관)는 이제 볼 수 있어야합니다. </li><li> 고환 및 WD를 잘라, 얼음에, HBSS와 신선한 페트리 접시에 보관하십시오. 하여 WD와 고환을 사용하려면, 요도에 첨부 파일에 가까운 정관을 잘라 gubernaculum에서 WD의 하부의 첨부 파일을 잘라. </li><li> 같은 그룹의 배아 (이 실험 계획에 따라 다를 수 있음)에서 고환 및 WDS 수영장. </li></ol> 배아 생식소 능선 3. 문화 (그림 2) <ol><li> 10 % FBS (소 태아 혈청), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 % L- 글루타민으로 DMEM / F12를 보충하여 배아 생식 융기 배양 배지를 준비한다. 수조에서 37 ° C로 미디어를 따뜻하게. </li><li> 24 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 300 μL 미디어를 추가한다. </li><li> 신선한 페트리 접시를 가지고 그것에 무균 HBSS의 작은 방울을 넣어. (0.8 폴리 카르 보 네이트 트랙 에치 막 넣어81, 그 빛나는 표면이 HBSS를 향 HBSS이 드롭 m). </li><li> 사용 청소 집게는 (위를 향하고, 그 거친 표면에) 막에 두 WDS와 생식선을 넣어 살균 물티슈 / 흡수 종이를 사용하여 HBSS의 최대 크기를 제거합니다. 흡수 종이로 조직을 만지지 마십시오; 그렇지 않으면, 조직이 손상된다. </li><li> WDS이나 생식선도이 서로 닿지되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면 이후의 배양 기간 동안 함께 스틱 것입니다. </li><li> 공기 매체 인터페이스 300 μL 배지 및 배양을 함유하는 24- 웰 플레이트의 웰에서 조직과 멤브레인을 전송. WDS의 낭성 성장에 막 결과에 너무 많은 배지. </li><li> 5 % CO 2의 존재하에, 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 매일 배양 배지를 변경합니다. 피펫으로 매체를 변경하려면, 잘 처음부터 매체를 제거하고 데워진 신선한 매체의 300 μL를 추가합니다. 노트:WD의 형태 형성에 다른 신호 경로의 영향을 연구하는데 필요한 농도에서 화학 활성제 및 / 또는 억제제가 배지에 첨가 할 수있다. </li><li> 문화 3 일의 조직. 3 일 내에서, 15.5 DPC 배아에서 수집 uncoiled WDS는 매우 선상 튜브 (그림 3B)로 변환. 의 Wnt 억제제 IWR1의 첨가는 코일 WD (도 3c)의 억제를 초래한다. </li><li> 수확 이러한 조직은 얼음처럼 차가운 PBS와 페트리 접시를 취할. 페트리 접시에 배양 생식선 및 WD와 멤브레인을 전송합니다. 멤브레인은 PBS에 떠 있습니다. PBS에서 싱크와 생식선 및 WD 꺼내 멤브레인을 누릅니다. </li><li> 4 ℃ 또는 실온에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) O / N와 조직을 고정한다. 필요한 경우, 고정하기 전에 WDS의 명 시야 이미지를 가져 가라. </li></ol> 4. 전체 마운트의 면역 형광 <ol><li> 세척 고정 된 조직은 PBS-T (PBS + 1 %로 3 배실온에서 천천히 흔들, 10 분 각각에 트리톤 X-100). </li><li> 천천히 흔들 (~ 30 RPM)와, 4 ° C에서 에탄올 (25 %, 50 %, 75 % 및 100 %), 10 분, 각각의 등급에 직렬로 조직 탈수. 이 단계에서, 조직을 75 % 에탄올을 4 ℃에서 저장 될 수있다. <ol><li> , 에탄올을 변경 2 분 동안 방해받지 않고 조직을 유지하고 수 있도록 조직이 정착. 가능한 상층 액을 가지고 에탄올의 다음으로 높은 농도를 추가합니다. 조직의 손상을 방지하기 위해, 피펫 팁은 모든 단계에서 조직을 만지지해야합니다. </li></ol></li><li> 탈수 후, 천천히 흔들 함께 4 ℃에서 에탄올 (100 %, 75 %, 50 % 및 25 %), 10 분, 각각의 등급에 직렬로 조직을 재수. </li><li> 부드러운 락 (~ 30 RPM)로, RT에서 PBS-T (PBS + 0.1 % 트리톤 X-100), 4 배속, 20 분 각각으로 조직을 씻으십시오. </li><li> 블로킹 완충액으로 RT에서 1 시간 동안 조직을 차단 (PBS + 1 % BSA + 0.2 % 무 지방 건조 우유 분말 + 0.3 % 트리톤 X-100). </li><li> AfteR 차단 (버퍼를 차단에 희석) 차 항체 용액에 조직을 전송하고 부드러운 락 (~ 30 RPM)와 4 ° C에서 O / N을 품어. 사용 된 일차 항체의 희석은 자료 표에 설명되어 있습니다. </li><li> 다음 날, 부드러운 락 (~ 30 RPM)로, RT에서 PBS-MT (PBS + 2 % 무 지방 분유 분말 + 0.5 % 트윈 20), 4 배속, 30 분 각각으로 조직을 씻는다. </li><li> 부드러운 락으로 차단 버퍼에 250 (이 단계는 개별 항체에 대한 최적화를 필요로) 및 실온에서 1 시간 동안 배양이 세척 단계 후, 1의 희석에 차 항체를 추가합니다. </li><li> 지금부터 이후 이차 항체가 빛에 민감 형광으로 표시 될 때 빛에 노출되지 않도록 알루미늄 호일로 덮여 조직을 유지. </li><li> 조직이 부드러운 락으로, PBS-T (PBS + 0.1 % 트윈 20), 30 분 각각 3 배 씻으십시오. </li><li> 스테인드 조직을 장착 슬라이드를 준비합니다. <ol><li> 이를 위해, 유리 커버 슬립 컷및 다이아몬드 펜을 사용하여 얇은 스트립으로 두 스트립 네일 에나멜을 사용하여 유리 슬라이드 위에 다른 하나를 스틱. 이 두 경계 사이에 두 경계와 장소 조직을 만듭니다. </li><li> DAPI 포함하는 설치 매체를 추가하고 커버 슬립에 넣어. 슬라이드에 그것을 해결하기 위해 커버 슬립의 모서리에 네일 에나멜을 적용합니다. 참고 : 조직은 이제 이미징을위한 준비가되어 있습니다. -20 ° C에서 다음 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

장기 배양 시스템은 기존의 세포 배양 시스템에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 시스템은 서로 다른 세포 유형 사이의 원래 구조 관계와 상호 작용을 유지합니다. 이는 생체 내 시스템에서 모방하고 틈새 계수가없는 세포 배양 과정보다 더 정확한 정보를 제공한다. 기관 배양 물 시스템의 사용은 심지어 전체 동물을 사용하여보다 이점이있다. 이 전체 동물, 쉽게 관리 및 기관 배양 물 시스템?...

남성 생식은 주로 고환 이루어져 생식 세포의 발생과 분화 및 정자의 성숙, 전송 및 저장을 위해 요구되는 복잡한 도관 시스템 사이트. 부고환은 정관과 고환 및 생식 세포 (1)의 후 고환 발달과 성숙에 주로 관여를 연결하는 관 모양의 기관이다. 고도로 꼬인 성인 마우스 부고환 간단한 직선 전구체 튜브 Wolffian 덕트 (WD) (1)로부터 발생한다. 정자 여성 생식 세포이 기름지게하는 능력을 획득하는 부고환 복잡하고 코일 구조가 필수적이다. 남성 불임에 대한 이러한 중요한 장기가 형태로 개발하고 얻는 방법을 잘 이해되지 않는다. 다양한 신호 경로는 예 Wnt 신호 전달 경로 및 경로 3,4- 5 시그널링 안드로겐으로 WD의 발달에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 우리의 최근 작품은 벨의 요구를 설립했다고급의 Wnt는 태아 개발 4시 WD의 코일 링에 대한 시그널링. 그러나, 상기 연구는 부고환 내 상피 및 간질 세포 생후 부고환 권취, 세포 분화 및 세포 간 통신에 관련된 메커니즘을 이해하기 위해 필요하다. 유전자 변형 마우스 모델은 다양한 기관 시스템 (6)의 개발 및 질병을 기본 분자 메커니즘의 식별 / 검증을위한 강력한 도구로 입증되었습니다. 광범위한 사용에도 불구하고, 추정 유전자 기능에 관해서 타겟 마우스 돌연변이의 예상치 못한 표현형, 일부 모델에서 널 (null) 돌연변이에 더 표현형, 유전 적, 환경 적 요인의 영향, 노동 집약적 등 유전자 변형 마우스 모델의 중요한 제한이있다 시간 소모적 마우스 모델을 개발하는 과정. 따라서, 단지 MODI 유전자에서 발견의 중요성 해석들이었다 마우스 모델은 항상 6 간단하지 않다. 이러한 제한은 우리 제어 배양 조건에서 실시간으로 다수의 신호 경로를 조작 할 수있는 유연성을 제공 관내 기관 배양 물 시스템의 사용에 의해 극복 될 수있다. 기관 배양 물 시스템은 전체 기관 (7)의 생리 병리학을 이해하는 수단이있다. 이되어 장기의 형태, 구조 및 기능 (8)의 더 나은 이해를 제공하고, 생체 내에서 존재하는 또, 형광 표지 된 항체로 염색하여 전체 장기의 화상은, 입체적 환경에서 관심있는 마커를 시각화 우릴 수있다. 여기, 우리는 WDS와 같은 관상 기관의 형태 형성에 대한 질문의 다양한 대답을 적용 할 수 있습니다 마우스 배아 생식 능선의 분리, 체외 문화와 WDS의 전체 마운트 면역 형광 이미징을위한 방법을 설명했다. 이 프로토콜에서, 우리15.5 일에서 격리 된 마우스 배아 비뇨 생식기 능선은 교미 (DPC) 임신 댐을 게시하고 상피 세포 마커 (사이토 케라틴 8, CK8), 세포 증식 마커 (포스 포 히스톤 3, PH3) 및 활성에 대한 면역 염색 한 다음 3 일 동안을 배양 βcatenin.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Interpath,&amp;nbsp; Australia</td><td>SH30034.02</td><td>10% FBS used in culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30034.01</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&amp;nbsp;</td><td>Whatman, USA</td><td>110409</td><td>Membrane (0.8 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma, USA</td><td>10161-5mg</td><td>100 &amp;micro;M concentration used</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>15710</td><td>16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot&lt;br/&gt; be disposed of in the sink</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Di-hydrogen Phosphate</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>465-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cytokeratin8/Troma I</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td><td>TROMA-I</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>active &amp;beta;catenin&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology,&amp;nbsp; USA</td><td>D13A1</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>phospho-Histone 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>111-545-047</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>112-585-072</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>242-500ml</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>n-Propyl galate</td><td>Sigma, USA</td><td>2370</td><td>-</td></tr><tr><td>2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td><td>Sigma, USA</td><td>D9564-10mg</td><td>Use to stain nucleic acids (DNA)</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2225-500ml</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Cover Slips (24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td>CS24501GP</td><td>-</td></tr></tbody></table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

두발 형태 형성은 남성 생식 기관을 포함한 대부분의 포유 동물의 개발을위한 기본 요건이다. 부고환, 남성 생식 기관의 중요한 부분은 기억 정자 성숙 및 전송에 대한 책임이있다. 성인 부고환은 Wolffian 덕트 (WD)로 알려진 단순하고 직선 배아 전구체로부터 개발하는 높은 코일 튜브입니다. 고환에서 정자가 난자와 수정 할 수 없습니다로 부고환의 적절한 코일 링은 남성 불임 필수적이다. 그러나, 부고환 개발 및 권취를 담당하는 메카니즘은 부분적으로 전체 기관 배양 및 촬상 방법의 부족으로 불분명. 본 연구에서, 우리는 더 나은 다른 관형 기관을 연구하기 위해 적용될 수있다 WD의 권취 및 발전 과정을 시각화 관내 배양 시스템 및 전체 마운트 면역 형광 프로토콜을 설명한다.

개발하는 동안, WD는 단순한 직선 튜브는 매우 복잡하고 코일 덕트로 변환되는 것을 특징으로 상당한 변화를 겪는다. 전술 한 방법을 사용하여, WDS는 배양 조건에서 유사한 변화를 겪는다. 여기에서 우리는 3 일 (그림 3) 배양 WDS의 결과를 보여 주었다. WD의 형태 형성에 관여하는 분자 메커니즘을 해부 배양액 다른 신호 경로를 표적 억제제 및 활성제로 보충 될 수있다. 그림 3C 특?...

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

우리는 마우스 Wolffian 덕트 (WD)의 분리 및 배양 방법을 제시한다. 우리는 또한 형광 태그 항체 배양 / 갓 격리 WDS의 전체 마운트 면역 염색에 대한 자세한 절차를 보여줍니다. 함께, 이러한 기술은 WD의 개발, 코일 링, 및 분화에 대한 연구를 할 수 있습니다.

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

organ-culture-whole-mount-immunofluorescence-staining-mouse-wolffian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K 조회수.  University of Newcastle.  우리는 마우스 Wolffian 덕트 (WD)의 분리 및 배양 방법을 제시한다. 우리는 또한 형광 태그 항체 배양 / 갓 격리 WDS의 전체 마운트 면역 염색에 대한 자세한 절차를 보여줍니다. 함께, 이러한 기술은 WD의 개발, 코일 링, 및 분화에 대한 연구를 할 수 있습니다. 

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

연구

발생학

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

암 연구학

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>체외 유기형성 중 1차 섬모형성을 연구하기 위한 오가노이드의 3차원 이미징

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

체외 유기형성 중 1차 섬모형성을 연구하기 위한 오가노이드의 3차원 이미징

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

유전학

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

신경과학

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

생물학

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

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식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부

체외 유기형성 중 1차 섬모형성을 연구하기 위한 오가노이드의 3차원 이미징

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전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

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