Sample Preparation, RNA Extraction, PCR Clean Up, and Quantification for Whole Genome Sequencing of Rabies Virus (RABV)

1.4mm 세라믹 비드로 가득 찬 약 200 마이크로리터 튜브로 2밀리리터 PCR 튜브를 채워 두 개의 세라믹 비드 튜브를 준비하고 멸균 후드 내부로 옮기기 전에 튜브에 라벨을 붙입니다. RNA 추출 키트에 제공된 권장 용량의 용해 완충액을 라벨링된 PCR 튜브에 추가합니다. 광견병 감염이 확인된 뇌 샘플에서 나무 어플리케이터를 사용하여 약 3mm 큐브를 채취하여 샘플 ID와 100마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 음성 대조군이라고 표시된 튜브에 넣습니다.

나무 어플리케이터 스틱을 사용하여 수동으로 뇌 조직을 파괴한 다음 완전한 조직 균질화가 이루어질 때까지 최대 속도로 소용돌이칩니다. 다음으로, 균질화 된 용해물을 원심 분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 새로 표지된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 추가 RNA 추출 단계, CDNA 준비 및 PCR 증폭에 사용합니다.

프라이머 풀 A 및 B를 사용하여 CDNA 준비 및 PCR 증폭 후 PCR 영역에서 PCR 클린업 및 정량을 수행합니다. 분취 SPRI 비드를 메인 병에서 마이크로 원심 분리기 튜브로 추출합니다. 이것들은 또한 미리 준비할 수 있습니다.

튜브를 섭씨 4도에서 보관하거나 차가운 선반이나 얼음에 보관하십시오. 다음으로, SPRI 비드 부분 표본을 약 섭씨 20도에서 데우고 완전히 와류하여 전체 용액에 비드를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 1.5밀리리터 튜브에서 각 샘플에 대해 프라이머 풀 A와 프라이머 풀 B PCR 산물을 결합합니다.

필요한 경우 물을 추가하여 부피를 25 마이크로 리터로 만든 다음 각 결합 제품에 25 마이크로 리터의 SPRI 비드를 첨가하고 혼합하십시오. 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양하고 가끔 튜브를 뒤집거나 튕깁니다. 다음으로, 비드와 용액이 분리될 때까지 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다.

완료되면 비드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 폐기하십시오. 그런 다음 갓 준비한 200 마이크로 리터의 80 % 에탄올을 사용하여 30 초 동안 두 번 씻고 에탄올을 버립니다. 두 번째 세척 후 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 모든 에탄올 흔적을 제거합니다.

미량 에탄올이 증발하고 펠릿이 광택에서 무광택으로 바뀔 때까지 펠릿을 공기 건조시킵니다. 비드를 15마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 다시 현탁시켜 세척된 DNA 산물을 회수하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 마그네틱 랙의 용액에서 비드를 분리합니다.

상층액을 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴 후, 뉴클레아제가 없는 물에 각 샘플을 1 내지 10 희석하여 준비합니다. 제조업체의 지침에 따라 고감도의 특정 형광측정기를 사용하여 희석된 각 샘플의 DNA 농도를 측정합니다.