Sequencing, Live and Offline Basecalling, Analysis, and Interpretation of Rabies Virus (RABV) Genome

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August 18th, 2023

DOI :

10.3791/200318-v

August 18th, 2023

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Criselda Bautista¹^,², Gurdeep Jaswant¹^,³^,⁴^,⁵, Hollie French¹^,⁶, Kathryn Campbell¹, Rowan Durrant¹, Robert Gifford¹^,⁶, Grace S. N. Kia⁷^,⁸, Brian Ogoti³^,⁹, Katie Hampson¹, Kirstyn Brunker¹^,⁶

¹School of Biodiversity, One Health & Veterinary Medicine, University of Glasgow, ²Research Institute for Tropical Medicine, ³University of Nairobi, Institute of Tropical and Infectious Diseases, ⁴Tanzania Industrial Research Development Organization, ⁵Ifakara Health Institute, ⁶MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, ⁷Department of Veterinary Public health, Ahmadu Bello University, ⁸African Centre of Excellence for Neglected Tropical Diseases and Forensic Biotechnology, Ahmadu Bello University, ⁹University of Nairobi, Kenya and Center for Epidemiological Modelling and Analysis, University of Nairobi

필기록

염기서열분석 장치 덮개를 뒤로 젖히고 프라이밍 포트 커버를 시계 방향으로 밀어 프라이밍 포트를 시각화하여 프라이밍 및 품질 확인 플로우 셀을 로드합니다. 기포를 제거하려면 P 1000 피펫을 200마이크로리터로 설정하고 피펫 팁을 프라이밍 포트에 수직으로 삽입합니다. 피펫 팁에 들어가는 작은 부피가 보일 때까지 휠을 돌립니다.

800 마이크로리터의 사전 준비된 플로우 셀 프라이밍 혼합물을 프라이밍 포트를 통해 플로우 셀에 로드하여 기포가 유입되는 것을 방지합니다. 샘플 포트 커버를 들어 올리고 프라이밍 포트를 통해 200마이크로리터의 나머지 프라이밍 혼합물을 플로우 셀에 로드합니다. 로딩 비드의 혼합을 보장하려면 피펫팅으로 라이브러리 마스터 믹스를 재현탁하고 적하 방식으로 샘플 포트를 통해 플로우 셀에 75마이크로리터를 로드합니다.

샘플 포트 커버를 부드럽게 교체하여 마개가 샘플 포트에 들어가도록 합니다. 프라이밍 포트를 닫고 시퀀싱 장치 덮개를 교체합니다. 라이브 베이스 호출의 경우 Rampart를 사용합니다.

Arctic RabV 환경을 사용하고 Rampart 출력에 대해 생성된 디렉토리에서 작업합니다. 그런 다음 Rampart 명령을 입력하여 필요한 경로로 이동합니다. 첫째, Rampart 특정 체계 프로토콜과 경로라는 다음 기반, 실행을 위한 mino fastq 패스 출력 폴더입니다.

브라우저 창을 열고 URL 상자에서 로컬 호스트 3000으로 이동합니다. 결과가 화면에 나타나기 전에 충분한 데이터가 기본 호출될 때까지 기다리십시오. 맨 위의 세 패널에는 전체 실행에 대한 요약 그림이 표시됩니다.

플롯 1은 인덱스 참조 게놈의 뉴클레오티드 위치당 각 바코드에 대해 매핑된 판독의 적용 범위를 보여줍니다. 그림 2는 시간 경과에 따른 모든 바코드의 매핑된 읽기를 보여주고, 그림 3은 바코드당 매핑된 읽기를 보여줍니다. 아래쪽 패널에는 바코드당 플롯 행이 표시됩니다.

왼쪽은 인덱스 참조 게놈의 뉴클레오티드 위치당 매핑된 판독의 커버리지 깊이를 보여줍니다. 매핑된 읽기의 길이 분포는 중간에 있습니다. 시간 경과에 따른 매핑된 판독의 10배, 100배 및 1000배 커버리지를 얻는 인덱스 참조 게놈에서 뉴클레오티드 위치의 비율은 오른쪽 모서리에서 볼 수 있습니다.

합의 시퀀스의 계보 할당에는 MadDog를 사용합니다. GitHub에서 MadDog 저장소를 가져와 최신 버전으로 작동하는지 확인하십시오. 이전에 만든 로컬 MadDog 저장소 내에 폴더를 만듭니다.

폴더 안에 합의 시퀀스가 포함된 fastA 파일을 추가합니다. 또한 폴더에 메타데이터 파일을 추가합니다. 이 파일이 ID, 국가, 연도 및 할당이라는 4개의 열이 있는 CSV인지 확인합니다.

GitHub에서 MadDog 저장소를 가져와 최신 버전으로 작동하는지 확인하십시오. 명령줄 인터페이스에서 conda activate MADDOG 명령을 사용하여 conda 환경을 활성화합니다. 명령줄 인터페이스에서 MadDog 리포지토리 폴더로 이동합니다.

먼저, 시퀀스에 대한 계보 할당을 수행하여 잠재적인 비정상을 확인하고 sh 할당을 실행하여 더 긴 계보 지정 단계를 실행하는 것이 적절한지 확인합니다. sh 명령. 메시지가 표시되면 Y를 입력하여 리포지토리를 가져와서 MadDog의 최신 버전으로 작동하는지 확인합니다.

메시지가 표시되면 MadDog 리포지토리 내에 fastA 파일이 포함된 폴더 이름을 입력합니다. 계보 할당이 완료되면 폴더에서 출력 파일을 확인합니다. 출력이 예상대로이고 여러 시퀀스가 동일한 계보에 할당된 경우 계보 지정을 실행합니다.

계보 지정을 실행하는 동안 방금 만든 할당 출력 파일을 삭제합니다. MadDog 리포지토리 폴더 내의 터미널에서 sh designation.sh 명령을 실행합니다. 메시지가 표시되면 Y를 입력하여 저장소를 가져오고 최신 버전의 MadDog로 작업이 완료되고 있음을 나타냅니다.

메시지가 표시되면 fastA 파일 및 메타데이터가 포함된 MadDog 리포지토리 폴더 내에 폴더 이름을 입력합니다. 광견병 바이러스 RABV에 대한 해석 워크플로우에 대한 샘플은 탄자니아, 케냐, 나이지리아 및 필리핀과 같은 풍토병 국가의 다양한 실험실 조건에서 성공적으로 사용되었습니다. Rampart를 사용한 라이브 베이스 호출은 실시간 판독 생성과 샘플당 커버리지 백분율을 보여주었습니다.

결과 RABV 시퀀스를 컴파일하고 해석하는 데 사용되는 계통 분류 및 명명법 시스템인 MadDog는 MadDog 할당 후 로컬 계통의 고해상도 분류를 보여주었습니다.

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