공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용한 탈세포화된 사과 유래 스캐폴드의 기공 크기 측정 및 세포 분포 분석

시작하려면 탈세포화된 사과 지지체를 인산염 완충 식염수로 세척합니다. 기공 크기 측정의 경우 10% 칼코플루오르 백색 용액 1mL에 스캐폴드를 실온의 어두운 곳에서 25분 동안 배양합니다. PBS로 스캐폴드를 세척한 후 고속 공진 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 레이저 방출 필터 구성을 설정합니다.

최적의 이미지 획득을 보장하기 위해 레이저 출력과 검출기를 수동으로 조정합니다. 5마이크로미터 단계 크기의 이미지 20개로 구성된 Z 스택을 획득합니다. 그런 다음 ImageJ 소프트웨어에서 Z project to maximum intensity 기능을 사용하여 이미지를 만들고 가장자리 찾기 기능을 적용하여 모공의 가장자리를 강조 표시합니다.

자유형 선택 도구를 사용하여 모공을 수동으로 추적합니다. 각 기공을 타원으로 맞추고 장축의 길이를 측정합니다. 모든 측정값을 컴파일하고 평균 길이를 계산합니다.

세포 분포 분석을 위해 적절한 배지에서 배양한 세포 시드 스캐폴드를 PBS로 3회 세척한 후 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정합니다. 그런 다음 각 스캐폴드를 탈이온수로 철저히 세척하고 Triton X-100 용액으로 5분 동안 세포를 투과시킨 다음 PBS로 다시 세척합니다. 스캐폴드를 1% 주기산 1밀리리터에 40분 동안 배양하고 탈이온수로 헹굽니다.

그런 다음 스캐폴드를 1밀리리터의 염색 용액에 완전히 담가 배양합니다. PBS로 스캐폴드를 세척하고 어둠 속에서 10분 동안 밀리리터당 5밀리그램의 DAPI 용액에 스캐폴드를 배양하여 세포핵을 염색합니다. 다시 철저히 씻고 비계를 PBS에 보관하십시오.

여기에 표시된 설정을 사용하여 고속 공진 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 세포 시드 스캐폴드를 10X 배율로 이미지화합니다. 최적의 이미지 획득을 보장하기 위해 레이저 출력과 검출기를 수동으로 조정하고 5마이크로미터 단계 크기로 20개의 이미지로 구성된 Z 스택을 획득합니다. 그런 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 컨포칼 이미지를 처리하고 Z project to maximum intensity 기능을 사용하여 이미지 분석을 위해 z축에 최대 투영을 생성합니다.

컨포칼 현미경 이미지의 정량화는 평균 약 154마이크로미터에서 73-288마이크로미터 사이의 공극 크기 분포를 보여주었습니다. 대부분의 기공은 100에서 200 마이크로미터 사이였습니다. 분화 배지에서 배양한 후, 스캐폴드에서 광물 침전물이 관찰되었습니다.

세포가 뿌려진 지지체는 광물화를 암시하는 불투명한 흰색을 보였는데, 이는 빈 발판에서는 관찰되지 않았다. 또한 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 분석을 통해 스캐폴드 내에서 균일한 세포 분포가 밝혀졌습니다.