Bacterial Extracellular Vesicles (BEVs) Enrichment from Human Faeces Using Differential Centrifugation Speeds

시작하려면 준비된 인간 대변 샘플을 채취하십시오. 고속 냉장 원심분리기를 섭씨 4도로 식힙니다. PBS를 사용하여 샘플 튜브의 무게를 0.1g로 조정하고 3, 000G에서 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다.

플라스틱 피펫을 사용하여 상층액을 1밀리리터를 남기고 두 개의 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그 후에, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 12, 000 G에 상층액을 분리하십시오. 20밀리리터 주사기를 사용하여 상층액을 흡인하고 주사기에서 바늘을 제거합니다.

0.22마이크로미터 필터를 통해 액체를 여과하여 50밀리리터 튜브로 넣습니다. 그런 다음 75% 알코올로 양동이를 닦아 남아 있는 오염을 제거합니다. 여과된 분변 상층액 약 30mL를 초원심분리 튜브로 옮깁니다.

튜브 입구에서 약 8mm의 간격을 두고 약 3밀리리터의 PBS를 튜브에 채웁니다. 두 개의 초원심분리기 튜브를 반대쪽 초원심분리 버킷에 놓고 PBS를 사용하여 두 버킷의 무게를 균등화합니다. 튜브가 적재되었는지 여부에 관계없이 모든 버킷을 로터에 적재합니다.

원심분리기에 있는 표본을 두고십시오, 진공을 시작하고 160에 회전시키고, 4 섭씨 온도에 70 분 동안 000 G. 원심분리가 완료되면 챔버 진공을 해제하고 울트라 원심분리기의 도어를 엽니다. 그런 다음 즉시 로터를 제거하십시오.

로터에서 랙으로 버킷을 옮기고 니퍼를 사용하여 튜브를 집어 올립니다. 상층액을 버리고 눈에 보이는 갈색 펠릿을 보관하십시오. 미리 식힌 PBS 1mL를 추가하여 펠릿을 완전히 재현탁시킵니다.

튜브에 약 37밀리리터의 PBS를 채우고 개구부에서 3밀리미터의 간격을 둡니다. 초원심분리를 한 번 더 수행한 후 상층액을 버리고 튜브를 5분 동안 뒤집은 상태로 둡니다. 와이퍼로 내벽에 남아 있는 용액을 제거합니다.

1, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여, 미리 식힌 PBS의 1.2 밀리리터를 펠릿을 재현탁하기 위하여 추가하고, 피펫팅에 의해 그(것)들을 섞는다. PBS BEV 용액 1.2mL를 초원심분리기 튜브 1개에서 깨끗한 1.5mL 마이크로 튜브로 옮깁니다.