Establishment of a Density Gradient Centrifugation System to Isolate and Purify Bacterial Extracellular Vesicles (BEVs) from Human Faeces

시작하려면 준비된 PBS/BEV 용액 500마이크로리터를 섭취하십시오. 3 밀리리터의 PBS와 결합하고 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합하십시오. 구멍이 있는 폼 플레이트에 31밀리리터 초원심분리기 튜브를 놓고 튜브에 아래쪽 화살표로 라벨을 붙입니다.

그런 다음 1, 000 마이크로 리터 피펫을 수직으로 잡고 튜브 바닥에 50 % 요오딕 산올 용액의 3 밀리리터를 추가하십시오. 튜브 홀더를 튜브 입구 아래의 폼 플레이트 높이보다 약간 높게 놓고 튜브를 70도 각도로 기울입니다. 1, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여, 50%iodixanol 해결책의 위에 40%iodixanol 해결책의 3 밀리리터를 추가하십시오.

그런 다음 40% 요오드산올 용액에 20% 요오드산올 용액 3밀리리터를 층층으로 덮습니다. 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여, 준비한 20 % 요오딕 산올 용액 위에 10 % 요오딕 산올 용액의 3 밀리리터를 추가하십시오. 다음으로, 10% 요오딕산올 용액 위에 PBS/BEV 용액 3.5밀리리터를 추가하고 튜브를 부드럽게 똑바로 세웁니다.

이제 구멍이 있는 폼 플레이트에 31밀리리터 초원심분리기 튜브를 놓고 위쪽 화살표로 라벨을 붙입니다. 1개, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여, 수직으로 관의 바닥으로 60%iodixanol 재고 해결책의 2.5 밀리리터를 추가하고, PBS/BEV 해결책의 500 마이크로리터도 50%iodixanol BEV 해결책의 3 밀리리터를 얻기 위하여 그것을 결합하십시오. 피펫팅으로 용액을 완전히 혼합합니다.

그런 다음 40, 20 및 10%요오드산올 용액을 순서대로 층화한 후 1, 000마이크로리터 피펫을 사용하여 10%요오드산올 용액 위에 PBS 3.5밀리리터를 추가합니다. PBS가 있는 두 튜브의 무게를 플러스 마이너스 0.005g 이내의 총 무게로 조정합니다. 다음에, 물통에 있는 관을 두고 160에 그(것)들을 분리하십시오, 4 섭씨 온도에 7 시간 동안 000 G.

피펫터를 사용하여 그래디언트 초원심분리 모드에서 얻은 분획을 측벽에 대해 위에서 아래로 순차적으로 수집하여 10개의 개별 38.5밀리리터 초원심분리기 튜브에 넣습니다. 그 때 ultracentrifuge 160에 분획, 4 섭씨 온도에 70 분 동안 000 G. 상층액을 제거하고 초원심분리기 튜브를 5분 동안 뒤집습니다.

다음으로, 200 마이크로리터 피펫을 사용하여 200 마이크로리터의 사전 냉각된 PBS에 펠릿을 재현탁시킵니다. PBS/BEV 용액을 깨끗한 1.5밀리리터 마이크로튜브에 옮깁니다. F1에서 F10까지의 분획을 하나의 그래디언트 초원심분리 모드에서 얻은 것으로 라벨링하고 분석을 진행합니다.