High-Throughput Screening of Compounds Using Neutrophils Isolated from Human Blood in a 384-Well Plate Format

혈청학적 피펫을 사용하여 15밀리리터 원심분리 튜브에 4밀리리터의 헤파린화된 인간 혈액을 8밀리리터의 밀도 구배 배지 위에 조심스럽게 층을 이룹니다. 섭씨 20도에서 30-50분 동안 550G에서 혈액을 원심분리합니다. 그런 다음 1mL 피펫을 사용하여 플라즈마 및 단핵 전지가 포함된 상층을 제거합니다.

하부 흐린 띠와 맑은 액체 아래 약 3-4밀리리터의 호중구를 10밀리리터의 PBS가 들어 있는 15밀리리터의 원심분리 튜브에 모읍니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 호중구 현탁액을 혼합합니다. 호중구 현탁액을 섭씨 20도에서 400G에서 10분 동안 원심분리한 다음 튜브에서 상층액을 조심스럽게 디캔팅하고 펠릿을 5밀리리터의 PBS에 재현탁시킵니다.

다시 섭씨 300도에서 10분 동안 서스펜션을 20G로 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후 진공 흡입을 사용하여 튜브 벽과 튜브 입구 주변에 남아 있는 상층액을 제거합니다. 펠릿을 1밀리리터의 호중구 배지에 재현탁시킵니다.

1.5 밀리리터 튜브에 1 밀리리터당 1.2 마이크로그램의 항체 용액과 0.2 밀리리터의 호중구 배지를 결합합니다. 25 마이크로리터의 항체 용액을 384웰 플레이트의 음성 대조군 웰에 추가합니다. 15밀리리터 튜브에 9밀리리터의 항체 용액, 21.6마이크로리터의 FMLP 용액 및 1.7784밀리리터의 호중구 배지를 결합합니다.

이 혼합물 25마이크로리터를 양성 대조군에 추가하고 384웰 플레이트에서 웰을 테스트합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 5마이크로리터의 복합 용액을 화합물 라이브러리 플레이트에서 384웰 플레이트로 옮깁니다. 서스펜션을 500G에서 1분 동안 원심분리합니다.

16채널 피펫을 사용하여 각 웰에 20마이크로리터의 호중구 현탁액을 추가합니다. 접시를 300RPM의 셰이커에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 고정하기 위해 각 웰에 16% 파라포름알데히드 3마이크로리터를 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.