이 방법은 살모넬라와 시겔라의 스크리닝을 위한 높은 처리량 플랫폼을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 반복, 구체적이고 민감하며 높은 처리량입니다. 이 기술은 실시간 PCR 검열이 먼저 적용된 NAAT 빠른 방법과 문화를 결합한 다음 박테리아 문화와 식별을 위해 양성 반응을 보냈습니다.
이 방법은 살모넬라와 Shigella 검열에 초점을 맞추고 있더라도, 또한 비브리오스, 황색포도상구균, E.Coli 및 등 세테라와 같은 그밖 병원체에 적용될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모는 시료의 배경 식물로 인해 올바른 식민지의 선택이 어렵기 때문에 중요합니다. 시작하려면 각 샘플에 3 밀리리터의 영양소 국물을 추가합니다.
그런 다음 샘플을 섭씨 36도에서 6시간 동안 배양합니다. 그 후, 원심분리는 2분 동안 800gs에서 사전 농축 문화를 분리한다. 그런 다음, 상체를 새로운 튜브로 옮기고, 원심분리기는 12, 000 gs에서 5분 동안 다시 분리한다.
상체를 폐기한 후 펠릿에 DNA 추출 용액 100마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 1 분 동안 소용돌이시다. 다음으로, 마른 목욕에서 1, 000섭에서 샘플을 가열합니다.
원심분리를 반복한 후, 상신관을 새로운 튜브로 수집합니다. 먼저 반응 혼합물을 만들고 텍스트 프로토콜에 따라 사이클링 프로그램을 설정합니다. 그런 다음 형광 실시간 PCR 기계에서 실시간 PCR을 수행합니다.
첫째, 셀레나트 크리스탈 배지의 5밀리리터에 사전 농축 배양의 100 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 18~24시간 동안 섭씨 36도에서 배양합니다. 다음으로, 문화의 하나의 루프를 수집하고 접시에 확산.
그런 다음 18 ~24 시간 동안 섭씨 36도에서 플레이트를 배양합니다. 잠복 후 의심스러운 식민지를 선택하고 접시에 옮기습니다. 18~24시간 동안 섭씨 36도에서 플레이트를 배양합니다.
그런 다음 자동화된 미생물 식별 시스템을 사용하여 의심스러운 식민지를 식별합니다. O-항원 특성화를 시작하려면 O 항원 다원체 세라 1방울을 깨끗한 슬라이드에 추가합니다. 콜로니의 루프 하나를 슬라이드로 옮기고 세라로 갈아보세요.
박테리아가 흐르는 모래처럼 보이면 항원이 특징일 때까지 O-항원 단원 세라로 이전 치료를 반복하십시오. H-항원 특성화를 시작하려면 H 항원 다원성 세라 한 방울을 깨끗한 슬라이드에 추가합니다. 그런 다음, 식민지의 하나의 루프를 수집하고 세라에 그리드.
H-항원 단원 세라를 사용하여 특정 H-항원이 특징화 될 때까지 치료를 반복하십시오. 문화를 분리하려면, 사전 농축 문화의 하나의 루프를 수집하고 접시에 확산. 그런 다음 18 ~24 시간 동안 섭씨 36도에서 장소를 배양하십시오.
잠복 후, 접시에 의심스러운 찾고 식민지를 수집합니다. 17~24시간 동안 섭씨 36도에서 플레이트를 배양합니다. 이어서, 식민지를 자동화된 미생물 식별 시스템을 사용하여 생화학적 식별을 적용한다.
다음으로, 깨끗한 슬라이드에 시겔라 종 폴리 발렌트 세라 의 한 방울을 적용합니다. 그런 다음 마이크로 루프를 사용하여 박테리아의 일부를 수집하고 세라로 갈아 넣습니다. 마지막으로, 세라가 흐르는 모래와 비슷하다면, Shigella 종 단가 세라를 사용하여 박테리아의 특성화를 더 합니다.
이 프로토콜을 사용하여, 환자에게서 대변 견본은 살모넬라와 Shigella 종을 위해 검열되었습니다. 실시간 PCR을 사용하여 HEX 채널에서 성공적인 증폭이 있었는데, 이는 샘플이 살모넬라 종에 대해 양성이었다는 것을 나타냅니다. 추가 실시간 PCR은 샘플 2살살모넬라에 대해 양성이며 유도 된 살모넬라 종 문화를 위해 선택되었다고 지적했습니다.
살모넬라 종의 유도 문화에서 분홍색과 보라색 식민지는 별도로 도금되어 생화학적 식별을 받았습니다. 그 결과 샘플 2의 콜로니가 살모넬라 파라티파이 B.를 사용하여 실시간 PCR을 사용했으며, FAM 채널에서 성공적인 증폭이 있었으며, 이는 시겔라 종에 대해 샘플이 양성이었다는 것을 나타낸다. 추가 실시간 PCR은 샘플 10이 Shigella에 대해 긍정적이며 가이드 문화를 위해 선택되었다고 지적했습니다.
시겔라 종의 유도 문화에서 분홍색 빨간색과 무색 식민지는 별도로 도금되어 생화학적 식별을 받았습니다. 결과는 견본 10이 Shigella sonnei 단계 II 박테리아를 포함했다는 것을 표시했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 시퀀스 변화로 인해 메서드의 한계를 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 직접 문화와 같은 다른 방법은 거짓 부정적인 실시간 PCR 결과를 피하기 위해 수행 될 수 있습니다. 이 기술은 새로운 프로토콜이 양수 비율을 두 배로 늘리고 워크로드와 TAT를 크게 감소시킬 수 있기 때문에 살모넬라 및 Shigella 탐지 분야의 연구자들이 길을 열어줍니다. 살모넬라와 Shigella와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 개인 보호 장비인 PPE는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.
