우리는 그의 결실의 의견과 제안 박사 이브 L. JANIN 감사합니다. 우리는 그녀의 기술 지원을 CHIK / 랜 C. Combredet에 HH 갓에게 감사의 말씀을 전합니다. 파스퇴르 만성 질환 Infectieuses (POV에 프로그램의 STING 및 HM--이 작품은 파스퇴르 연구소, 센터 내셔널 드 라 공들인 Scientifique (CNRS), 문화원 국립 드 라 상테 동부 표준시 드 라 공들인 Médicale (INSERM), 문화원 카르노에 의해 지원되었다 L), 직원은 국립 라 공들인 POV에 (ANR-RPIB, 프로그램 STING 2.0), 그리고 &quot;헌법위원회 지역 일 드 프랑스&quot;(화학 도서관 프로젝트를 부어, 보조금은 N I 06-222 / R을 ° 및 I HM-L에 09-1739는 / R.). CHIKV / 르네의 작품은 프로젝트 ArbOAS에 의해 지원되었다 (ANR 보조금 2010 INTB - 1601-02).

화합물과 96 웰의 딸 플레이트 1. 준비 <ol><li> 실내 온도 -20 ° C에서 DMSO 화학 화합물의 10 mM의 주식 솔루션을 포함하는 96 - 웰 어머니 플레이트를 이동합니다. 희석 화합물은 2 ㎜에서 중간 96 - 웰 희석 판을 얻​​기 위해 DMSO에 5 배. 희석은 DMSO 20 ㎕로 5 μl를 피펫과 혼합하여 얻을 수있다. </li><li> 피펫 흰색, 바코드 조직 문화 96 - 웰 플레이트의 마른 우물에 희석 플레이트에서 1 μL. 보조 플레이트 (D1)이 첫 번째 세트는 20 μM의 최종 농도에서의 화합물의 독성을 평가하는 데 사용된다. -20 ° C까지 사용에 보관 딸 접시. </li><li> DMSO와 혼합 36 μL로 희석 플레이트에서 4 μl를 피펫으로 다시 1:10 화합물을 희석. 흰색, 편평한 바닥, 바코드 조직 문화 96 - 웰 플레이트의 마른 우물에 피펫 1 μL. 딸 플레이트 (D2)의 두 번째 세트는 MV의 replicatio의 억제를 평가하는 데 사용됩니다2 μM의 최종 농도에서 화합물에 의한 N. -20 ° C까지 사용에 보관 딸 접시. </li></ol> 2. 세포 배양의 제조 화합물의 독성을 확인하는 <ol><li> 37 ° C에서 HEK-293T 세포를 성장, 5 % CO 2 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 안정화 된 L-글루타민, 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 스트렙토 마이신 (100 ㎍ / ㎖), 페니실린과 보충 ((100) IU / ㎖). 세포는 모든 4~5일 트립신 처리하여 계대하고 신선한 플라스크에 1:10으로 희석된다. 세포 실험에 대한 로그 상에 있어야합니다. </li><li> 실험 당일, 트립신 처리에 의해 균체를 회수하고 세포 카운팅을 수행한다. 펠렛 원심 분리하여 세포 및 배지에서 3 × 10 5 세포 / ml에서 그들을 재현 탁. 세포 현탁액의 12.5 ㎖를 각각 검사 판에 필요한 것을 고려하십시오. </li><li> 전송 통에 세포 및 아군 화학 COMPO를 포함 D1 플레이트에 세포 현탁액 100 μl를 분배unds. 저점 내에서 세포 현탁액은 정기적으로 침전을 방지하기 위해 교반된다. </li><li> DMSO의 1 μL와 제어 우물 A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12와 G12 스파이크. 해당 우물은 살아있는 세포에 대한 참조 (독성)로 사용됩니다. 제어 우물 B1 스파이크, D1, F1, H1, DMSO의 1 μL와 세포를 죽일 수있는 0.5 % IGEPAL 솔루션의 2.5 μL와 B12, D12, F12과 H12. 해당 우물은 죽은 세포에 대한 참조 (높은 독성)로 사용됩니다. </li><li> 37 ° C에서 24 시간 동안 세포를 품어 5 % CO 2. </li></ol> rMV2/Luc에 의해 감염된 세포 배양 3. 준비 <ol><li> 성장과 2.1 및 2.2에 설명 된대로 세포를 복구 할 수 있습니다. 다시, 배양 배지에서 3 × 105 세포 / ml로 재현 탁 세포. 세포 현탁액의 12.5 ㎖를 각각 검사 판에 필요한 것을 고려하십시오. </li><li> 선택 사항 : 20 ㎍ / ml로 우리 딘과 보충 배지. 참고 : 바이러스 replicatio 화학 라이브러리를 심사 할 때N 억제제는 피리 미딘 생합성 경로의 초기 단계를 표적 화합물이 자주 13,16,27,28 격리되는 것으로 보인다. 배양 배지로 우리 딘의 첨가는 이러한 바이러스 분자를 필터링하기 위해 사용된다. 사실,이 효율적으로 피리 미딘 생합성 경로의 상류 효소가 차단 바이러스 복제를 복원합니다. </li><li> 감염되지 않은 세포와 제어 우물에 세포 현탁액 1:10 저장하고 잔량 감염으로 진행합니다. </li><li> rMV2/Luc 스톡 용액의 적절한 용적을 해동. MV 주식 솔루션은 ML 당 10 6 -10 8 감염성 입자에 일반적입니다. 문화 감염 (MOI)의 0.1 다수에 해당하는 표적 세포 당 rMV2/Luc 0.1 감염성 입자에 감염되어 있어야합니다. 참고 : rMV2/Luc는 MV 백신 (슈바르츠 균주)에서 파생되며 BSL2 환경에서 조작 할 수 있습니다. </li><li> 세포 현탁액에 바이러스를 추가하고 부드럽게 섞는다. 구유에 감염된 세포를 전송하고, 100을 분배열 2 아군 화합물을 포함하는 D2 플레이트 (11)에 감염된 세포 현탁액의 μL. 저점 내에서 세포 현탁액은 정기적으로 가볍게 혼합한다. </li><li> 열 1, 12, 100 감염되지 않은 세포의 μL 잘 두를 분배. 감염된 세포는 다른 우물에 분배된다. </li><li> 37 ° C에서 24 시간 동안 세포를 품어 5 % CO 2. </li></ol> 4. 루시 페라 제 활동 측정 및 데이터 분석 <ol><li> 인큐베이터에서 D1 플레이트를 제거하고 직접 문화 우물에 루시 페라 기반의 생존 시약의 5​​0 μl를 추가하여 세포 생존 능력을 결정합니다. 섞고 실온에서 10 분 동안 배양한다. 루미와 함께 접시를 참조하십시오. 통합 시간은 물론 당 100 밀리 초에 설정되어 있습니다. </li><li> 인큐베이터에서 D2 플레이트를 제거하고 직접 문화 우물에 루시 페라 제 기판의 50 μl를 추가하여 루시퍼 라제 활성을 결정합니다. 실온에서 10 분 동안 배양하고, descri로 루미와 함께 접시를 읽고위의 침대. </li><li> 화면 (29)의 품질을 보증하기 위해 독성 분석의 각 D1 플레이트 Z &#39;계수를 계산한다. μ +와 σ + 혼자 DMSO와 HEK-293T 세포에 대한 발광 및 표준 편차 (독성)의 수단에 해당 - (μ-, Z &#39;= 1-3 * (σ + + σ-) / μ +) 및 μ 및 발광 세포를 죽일 IGEPAL로 치료 문화 우물에 대한 표준 편차의 수단은 σ-입니다. Z &#39;는 0.5 이상이 될 것으로 예상되고, 또는 해당 플레이트는 폐기된다. </li><li> μ + / 2에 독성 임계 값을 설정합니다. 이 컷 - 오프 (그림 3A) 아래 발광 값으로 화합물을 폐기하십시오. </li><li> 항 바이러스 분석의 각 D2 플레이트 Z &#39;계수를 계산한다. 여기서, μ +와 σ + 혼자 DMSO 배양 감염된 세포에 대한 발광 및 표준 편차의 수단에 해당하고, μ 및 감염되지 않은 세포에 대한 발광 및 표준 편차를 통해 σ-입니다. 또, Z &amp; #와 접시39; 0.5 아래의 값은 삭제됩니다. </li><li> - / (μ + - μ-) * 100 = (화합물 X에 대한 루시 페라 제 활동 μ +) 억제의 비율 : 다음과 같이 바이러스 복제의 억제를 계산합니다. 최대 75 %에 억제 임계 값을 설정하고 모두가이 컷 - 오프 (그림 3B) 아래 발광 값을 줄이고 4.4에 기술 된 기준에 따라 독성이없는 화합물을 선택합니다. </li></ol> 독성 및 광범위한 스펙트럼 항 바이러스 활동에 대한 5. 보조 화면 <ol><li> 각 1:2 직렬 희석 500 μM 4 μM (8 희석)에서 시작, DMSO의 화합물을 치다. 문화 매체의 50 μL 흰색, 바코드 조직 배양 접시를 입력합니다. 문화 우물에서 각 화합물의 희석 1 μl를 추가합니다. 각각의 히트 화합물에 대한 중복 된 시리얼 희석 3 배양 플레이트를 두 번 반복합니다. </li><li> (전술 한 바와 같은 배지에서 6 × 105 세포 / ml로 HEK-293T 세포 현탁액의 37.5 ml의 준비 2.1 및 2.2). 팔콘 튜브에 2 배 12.5 ㎖에 분배하고 MOI에서 rMV2/Luc 하나와 세포를 감염 = 0.1 MOI에서 레 닐라 루시퍼 (CHIKV / 렌)를 발현하는 재조합 CHIKV는 0.2 =. 반전 섞는다. 참고 : CHIKV / 렌 CHIKV의 야생형 균주로부터 유래하므로 BSL3 환경에서 조작되어야한다. 레 닐라 기판 문화 우물에 추가되면 플레이트 (아래 참조) BSL1에 BSL3에서 이동할 수 있습니다. </li><li> 히트 화합물의 시리얼 희석을 포함하는 배양 접시에서, 감염되지 않은 rMV2/Luc-infected, 또는 CHIKV / 렌에 감염된 세포의 50 μl를 분배. 37 ℃에서 24 시간을 품어 </li><li> rMV2/Luc-infected 우물 반딧불 루시 페라 제 활성을 측정하기 위해 반딧불 루시 페라 제 기판의 50 μl를 추가합니다. CHIKV / 르네 감염 우물에서 레 닐라 루시퍼 라 아제 활성을 결정하는 레 닐라 루시퍼 기판의 50 μl를 추가합니다. 마지막으로, 세포 생존 능력을 결정하기 위해 감염되지 않은 세포에 루시퍼 기반 생존 분석 시약의 5​​0 μl를 추가합니다. </li><li> 플롯 데이터 (무선 인터넷gure 4)과 50 % MV 및 CHIKV 복제를 억제 히트 화합물의 농도를 결정합니다. 이 분석에 약간의 독성을 나타내는 화합물을 무시하십시오. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에서 설명하는 심사 파이프 라인은 RNA 바이러스의 광범위한 스펙트럼 억제제로서 적절한 프로필과 화합물을 선택 목표로하고있다. 10,000 화합물의 라이브러리가이 프로토콜 및 상기 필터링 기준이 적용된 함께 상영되었을 때, 75 %, 40 화합물 (0.4 %)으로 우수한 MV 복제 즉, 억제는 긍정적 인 기록했다. 게다가, 이들 중 절반은 루시페라아제 기반 생존력 분석에서 어떤 독성을 보였으며, 이...

RNA 바이러스는 인간 감염의 큰 다양성에 대한 책임이 있으며, 공공의 건강과 경제적 비용의 측면에서 전 세계적으로 인구에 큰 영향을 미친다. 효과적인 백신은 여러 가지 인간의 RNA 바이러스에 대해 개발되어 널리 예방 치료로 사용됩니다. 그러나 RNA 바이러스 감염에 대한 치료 약물의 중요한 부족은 여전히​​있다. 사실, 효율적인 백신은 뎅 그열 바이러스, C 형 간염 바이러스 또는 인간의 호흡기 세포 융합 바이러스 (hRSV) 등 주요 인간의 병원체에 대해 사용할 수 없습니다. 게다가, RNA 바이러스로 인해 글로벌 교류와 생태계에 대한 인간의 영향의 빈도가 증가하고 새로운 질병의 대부분에 대한 책임이 있습니다. RNA 바이러스를 나타내는이 위협에 대해, 우리의 치료 아스날은 매우 제한적이며 1-3 상대적으로 비효율적이다. 현재 치료는 본질적으로, 선천성 면역을 자극하는 재조합 I 형 인터페론 (IFN-α / β)를 기반으로또는 리바비린의 관리. 이 리보 아날로그의 작용 모드가 논란이 아마 다양한 메커니즘에 의존하고 있지만, 세포 내 GTP 풀을 고갈 휴대 IMPDH (이노신 인산 탈수소 효소)의 억제, 4 명확 필수적이다. 리바비린은 페 길화 된 IFN-α와 결합, C 형 간염 바이러스에 대한 주요 치료입니다. 그들이 효율적으로 무딘 IFN-α / β는 5 요인 독성의 발현을 통해 신호 종종 리바비린 3 탈출 그러나, IFN-α / β와 리바비린 치료는 대부분의 RNA 바이러스에 대한 생체 내에서 상대적으로 가난한 효능이다. 가 최근 논란이 혜택을 6 심각한 hRSV 질환에 대해 승인을 받았다하더라도 이것은, 리바비린 치료가 중요한 독성 문제를 제기한다는 사실에 추가됩니다. 최근에, 일부 바이러스 특정 치료법 개발 O와 인플루엔자 바이러스, 특히, 시판 된F 뉴 라미니다 아제 억제제 3. 그러나, 큰 다양성과 RNA 바이러스의 영구 출현은 상대적으로 가까운 미래에 그들의 각 하나에 대한 특정 치료법의 개발을 배제한다. 합해서, 이는 가까운 미래에 강력한 항 바이러스 분자를 확인하고 개발하는 효율적인 전략에 대한 필요성을 강조한다. 그것은 RNA 바이러스의 대형 패널에 대한 활성 광범위한 스펙트럼 억제제는이 문제를 해결하는 것이 말을 간단하다. 이러한 분자가 여전히 바이러스 학자의 꿈이지만, 세포 방어 메커니즘 및 선천성 면역 체계의 우리의 더 나은 이해는 몇 가지 가능성이 7,8 존재하는 것이 좋습니다. 여러 학문과 산업 연구소는 지금 세포 방어 메커니즘이나 바이러스 복제를 무디게하는 대사 경로의 특정 측면을 자극 분자를 찾고 있습니다. 이러한 화합물은 아마도 상당한 부작용을 보여줍니다 있지만, 급성 바이러스 감염에 대한 치료 관리하기 될 것이다장기에 대한 몇 가지 잠재적 인 독성에도 불구하고 그들을 허용하고, 비교적 짧은 시간에 에드. 다양한 전략은 광범위 항 바이러스 분자를 식별하기 위해 개발되었다. 일부 연구 프로그램은 특정 방어 나 대사 경로를 표적 분자를 발견을 목표로한다. 여기에는, 예를 들면, 바이러스 유전자 발현 구를 유도하고 RNaseL 10, 바이러스 저하 11을 촉진하기에 autophagy 기계와 같은 항 바이러스 요소를 활성화하는 병원체 인식 수용체는, 뉴 클레오 시드의 합성은 바이러스에 감염된 세포의 죽음을 침전 12,13 또는 사멸 캐스케이드 경로 14. 다른 그룹 13,15-17 목표를 기반으로하지 않는 표현형 스크린을 개발했습니다. 그 경우, 바이러스 분자는 단순히 관련 셀룰러 시스템에서 바이러스 복제를 차단하는 그들의 능력에 의해 식별된다. 일반 가정은 2-3 관련이없는 RNA 바이러스를 억제하는 화합물은 광범위한 SP에 적합한 프로필을 것입니다항 바이러스 분자를 ectrum. 이러한 경험적인 접근 방식을 선택 히트 화합물의 작용 모드는 두 번째 시간에 결정되고, 결국, 항 바이러스제에 대한 새로운 표적 세포의 식별로 이어질 수 있습니다. 흥미롭게도, 1999 년과 2008 년 사이 미국 식품 의약청의 승인 신약의 회고 분석은 일반적으로, 표현형 검사는 첫 번째 수준의 작은 분자 약물 (18)를 발견하는 목표 기반의 방법보다 더 나은을 수행하는 경향이있는 것으로 나타났습니다 . 높은 처리량 세포 기반 분석에서 바이러스 복제는 일반적으로 바이러스가 세포 변성 효과에서 결정된다. 세포는 감염 배양 96에 - 또는 시험 화합물의 존재 384 - 웰 플레이트. 몇 일 후, 세포의 층을 고정하고 크리스탈 바이올렛 등의 염료로 염색. 마지막으로 흡광도는 플레이트 판독기 및 바이러스 복제를 억제하는 화합물이 앞뒤로 세포 층을 보존하는 그들의 능력에 의해 확인되어 결정된다m 바이러스 - 유도 세포 변성 효과. 또한, 바이러스 성 매개 세포 변성 효과는 이러한 MTS 감소와 같은 표준 생존 분석을 사용하여 평가됩니다. 이러한 분석은 매우 온순하고 비용 효과가 있지만, 세 가지 주요 제한의 고통. 첫째, 그들은 따라서 19에 근접 대안을 호출, 바이러스 복제는 몇 일에 세포 변성하지만이 항상 가능한 것은 아니다 바이러스 세포의 조합을 필요로한다. 둘째, 그들은 바이러스 복제의 간접적 인 측정에 기초하고 있기 때문에 저조한 정량적이다. 마지막으로, 독성 화합물은 포지티브 히트로서 획득 될 수 있고, 따라서 세포 생존 능력을 측정하는 카운터 스크린으로 제거되어야한다. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 재조합 바이러스 나 플리는 추가 전사 단위 또는 바이러스 단백질 유전자 (몇 가지 예는 20 ~ 23입니다) 프레임에, 같은 EGFP 또는 루시 페라 제 등의 리포터 단백질을 표현하는 역 유전학에 의해 설계되었다. 이 바이러스는 복제, 기자 홍보oteins는 바이러스 단백질 자체와 함께 생산된다. 이 바이러스 복제를 측정하고 후보 분자의 억제 활성을 평가하기 매우 정량적 분석을 제공한다. 이것은이 기자 시스템은 높은 감도와 거의없이 배경으로 넓은 동적 범위를 전시 이후 루시 페라 제 (또는 생물 발광 할 수있는 다른 효소)를 발현하는 재조합 바이러스에 특히 사실이다. 한층 더 여기 광원 따라서 형광 화합물 (24)과의 간섭을 방지 없다. 여기, 우리 세부 높은 처리량 프로토콜은 RNA 바이러스의 광범위한 스펙트럼 억제제 화학 라이브러리를 화면으로. 화합물은 반딧불 루시 페라 제 25 (rMV2/Luc, 그림 1, 기본 화면)를 발현하는 재조합 홍역 바이러스 (MV)에 감염된 인간의 세포에서 먼저 테스트됩니다. MV는 주문을 Mononegavirales에 속하고 종종 부정적인 가닥 RNA 바이러스의 프로토 타입 멤버로 간주됩니다에스. 이와 같이, MV 게놈은 바이러스 성 단백질을 코딩하는 mRNA의 분자를 합성하는 바이러스 중합 효소에 의해 주형으로 사용된다. rMV2/Luc라는 재조합 MV 변형에서 루시 페라 제 표현은 P와 M 유전자 (그림 2A) 사이에 삽입 추가 전사 단위에서 표현된다. 병렬로, 화합물 ATP 정량화하여 평가하는 상업 루시 페라 기반의 시약을 사용하여 인간의 세포에 자신의 독성 시험, 문화의 대사 활성 세포의 수 (그림 1, 기본 화면). 전체 화학 라이브러리는 용이하지 않은 독성 및 MV 효율적 복제를 차단하는 화합물을 선택하기 위해 이들 두 분석으로 스크리닝 할 수있다. 그리고, 히트는 Chikungunya의 바이러스 (CHIKV) 복제 (도 1, 보조 화면) 저해하는 그들의 능력에 대한 용량 - 반응 MV ​​복제의 억제, 독성의 결여 등을 위해 다시 테스트된다. CHIKV는 Togaviridae 가족의 일원이며 게놈은 AP 통신ositive 단일 가닥 RNA 분자. 따라서, 그것은 홍역 MV와 CHIKV 모두 RNA 바이러스의 대형 패널을 억제 할 수있는 좋은 기회가 억제 화합물에 전혀 관계가없는 것입니다. 구조 단백질이 전사 및 subgenomic의 mRNA 분자의 번역에 의해 인코딩되는 반면 CHIKV 비 구조 단백질은 직접 바이러스 게놈에서 변환됩니다. CHIKV에 대한 우리의 체외 복제 분석은 nsP3 및 NSP4 시퀀스 26 (그림 2B) 사이의 리포터 유전자의 삽입을 통해 비 구조적 폴리 단백질의 절단 된 부분으로 레 닐라 루시퍼 라 아제 효소를 표현 CHIKV / 르네라는 재조합 균주를 기반으로합니다. 레 닐라 루시퍼 라제 활성의 척도 CHIKV 생활주기의 초기 단계에서 바이러스 복제의 모니터링을 허용한다. 이것은 높은 처리량 프로토콜은 빠르게 만 molec의 상용 라이브러리 광범위 항 바이러스제에 대한 적합한 프로파일 갖는 화합물을 식별하는 데 사용되었다ules 화학 다양성이 풍부한. 화합물은 기본적으로 250에서 600 달톤에 이르는 분자량, 다섯 리핀 스키의 규칙에 따라, 5 이하 D 값을 기록했다.이 분자의 대부분은 다른 상용 라이브러리에서 사용할 수없는 새로운 화학 엔티티했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

RNA 바이러스는 독감, 기관지염, 뎅 그열, C 형 간염 또는 홍역과 같은 주요 인간의 질병에 대한 책임이 있습니다. 그들은 또한 때문에 점점 더 많은 자연 생태계를 관통 증가 세계적 교류와 인간의 인구의 신흥 위협을 나타냅니다. 이러한 새로운 상황의 좋은 예는 인도양 2005에서 2006 사이의 Chikungunya의 바이러스 전염병이다. 바이러스 복제를 제어하는​​ 세포 경로에 대한 우리의 이해의 최근 진행되는 호스트 세포의 기능을 대상 화합물은, 오히려 바이러스 자체보다, RNA 바이러스의 대형 패널을 억제 할 수있는 것이 좋습니다. 일부 광범위한 스펙트럼 항 바이러스 화합물은 호스트 목표 지향적 인 분석으로 확인되었습니다. 그러나, 세포 배양에 바이러스 복제의 억제를 측정하는 것은 판독으로 세포 변성 효과의 감소를 사용하는 것은 여전히​​ 가장 중요한 검사 방법을 나타낸다. 이러한 기능적인 스크린에는 크게 리포터를 발현하는 재조합 바이러스의 개발에 의해 개선 된 주 효소이러한 루시퍼 같은 생물 발광의 pable. 본 보고서에서는 세부 광범위한 스펙트럼 항 바이러스 프로필과 화합물을 식별하기 위해, 재조합 홍역 및 세포 생존 능력의 분석과 Chikungunya의 바이러스를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을,.

이 검사 파이프 라인은 MV 복제를 억제하는 화합물의 선택에 첫 의존하고 중요한 세포 독성 (그림 1, 기본 화면)을 표시하지 않습니다. 그것은 세포 독성과 바이러스 복제 억제를 결정하는 루시 페라 기반의 분석을 활용합니다. 모든 피펫 팅 단계 및 데이터 수집은 로봇 플랫폼 높은 처리량 설정에서 수행 될 수있다. 화합물의 세포 독성은 대사 활성 셀에 대응하는...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K 조회수.  Institut Pasteur, CNRS UMR3569.  바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을. 

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

연구

면역학 및 감염병학

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

뉴 클레오 캡시드 소둔 매개 전기 영동 (NAME) 분석은 HIV-1 뉴 클레오 캡시드 억제제의 신속한 식별을 할 수 있습니다

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

세균성 지속성에 미치는 영향을 밝히기 위해 화학 화합물의 높은 처리량 선별

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...