Removal of Debris and Red Blood Cells from CNS Cell Suspension of EAE Mice

시작하기 위하여는, 중추신경계 조직의 해리 후에 세포 펠릿을 얻고 1개의 15 밀리리터 관에 있는 DPBS의 3, 100 마이크로리터로 그것을 다시 현탁시키십시오. 소용돌이치지 마십시오. 1개, 성인 뇌 해리 키트의 파편 제거 용액 800마이크로리터를 2개의 풀링된 CNS 세포 현탁액에 추가합니다.

튜브를 뒤집고 서스펜션을 혼합한 다음 4ml의 차가운 DPBS로 부드럽게 오버레이하고 명확한 기울기를 관찰합니다. 3, 가득 차있는 가속도 및 틈을 가진 4 섭씨 온도에 000g에 10 분 동안 관을 분리하십시오. 원심 분리 후 3 단계가 형성됩니다.

두 개의 상부 단계를 완전히 흡인하고 폐기하여 미엘린 잔류물이 남지 않도록 합니다. 튜브에 최대 14밀리리터의 차가운 DPBS를 채우고 닫습니다. 셀 펠릿이 튜브 바닥에서 분리될 때까지 작업대에 힘을 주어 튜브를 뒤집습니다.

샘플을 원심분리하고 상층액을 완전히 흡인합니다. 적혈구 제거를 위해 적혈구 제거 용액 1mL를 세포 펠릿에 첨가하십시오. 펠릿을 다시 현탁시킨 후 용액을 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 10mL의 차가운 PB 완충액을 추가하고 샘플을 원심분리한 다음 상층액을 완전히 흡인합니다. 세포 계수를 위해 세포 현탁액을 PB 완충액에 50배 희석한 다음 0.4% Trypan Blue 용액에 1-10배 희석합니다. 그런 다음 개선된 계수 챔버를 사용하여 세포 수를 결정합니다.