먼저 멸균된 50밀리리터 원추형 튜브에 8밀리리터의 DPBS를 추가합니다. 여기에 8 밀리리터의 혈액을 넣고 3 밀리리터의 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 내용물을 잘 섞습니다. 15mL의 림프구 분리 배지를 다른 원추형 튜브에 추가합니다.
튜브를 20-30도 기울입니다. 그런 다음 3 밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 혈액 DPBS 혼합물의 첫 번째 층을 분리 배지 위에 부드럽게 적용합니다. 나머지 혼합물을 튜브의 측벽 위에 조심스럽게 겹칩니다.
튜브를 천천히 똑바로 세워 남은 혈액을 혈액층에 겹쳐 놓습니다. 브레이크를 끈 상태에서 스윙 버킷에서 실온에서 10분 동안 튜브를 10G로 원심분리합니다. 혈액 PBMC 혼합물은 4개의 별개의 층으로 분리됩니다.
파스퇴르 피펫을 사용하여 플라즈마 층의 2/3를 제거한 다음 1밀리리터 피펫을 사용하여 PBMC를 수집합니다. 전체 층이 수확될 때까지 PBMC를 새 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 DPBS로 부피를 최대 25밀리리터까지 만들어 잔류 분리 매체 및 기타 잔류물을 제거합니다.
브레이크를 켠 상태에서 실온에서 100G에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 진공 펌프로 상층액을 제거합니다. 다음으로, 펠릿을 1밀리리터 DPBS로 재현탁시키고 더 많은 DPBS를 추가하여 부피를 25밀리리터로 만들어 펠릿을 세척하고 재현탁합니다.
냉동 용기를 섭씨 4도로 식힙니다. 그런 다음 소 태아 혈청을 얼음 위에 놓습니다. 분리된 PBMC를 함유한 세포 펠릿을 소 태아 혈청 1밀리리터에 재현탁시킵니다.
다음으로 DMSO와 냉각된 혈청을 얼음 위에 1:5의 비율로 혼합합니다. 수집 튜브당 하나의 튜브를 사용하여 셀 현탁액을 2mL 라벨이 부착된 cryotube로 옮깁니다. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수와 생존율을 측정할 수 있습니다.
1밀리리터 피펫을 사용하여 DMSOFBS 혼합물 1밀리리터를 튜브에 떨어뜨립니다. 그런 다음 튜브를 예냉식 냉동 용기에 넣습니다. 용기를 섭씨 영하 80도의 냉동실에 24시간 동안 보관합니다.
다음날 냉동실에서 튜브를 꺼내 액체 질소의 기체 상태에 보관하십시오. 세포 수와 생존율은 냉동 보존 전후에 일관되어 성공적인 분리 및 보존을 나타냅니다.
