Tissue Embedding and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

시작하려면 쥐의 심장에서 좌심방과 폐정맥 또는 PV를 분리합니다. 분리된 조직을 심장 기저부와 폐 정점이 위를 향하도록 하여 냉동 몰드에 넣습니다. PV가 복잡할 경우를 대비하여 PV를 풀고 풀어야 합니다.

그런 다음 냉동 몰드를 OCT 화합물로 채웁니다. 미세한 집게를 사용하여 PV를 움직이지 않고 부드럽게 압축하여 잔류 공기를 제거합니다. OCT 화합물의 조직을 드라이 아이스에 얼립니다.

면역염색을 위해 냉동된 마우스 PV 슬라이드를 염색 시스템에서 20분 동안 해동합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드 고정 용액을 절편에 여러 방울 떨어뜨려 조직을 슬라이드에 고정합니다. 배양 후 슬라이드를 수직 랙으로 옮기고 PBS로 채워진 용기에 담그십시오.

용기를 느린 셰이커에 5분 동안 올려 슬라이드를 헹굽니다. 자일롤이 함유된 액체 차단 펜을 사용하여 모든 슬라이드의 각 섹션을 둘러쌉니다. 그리고 염색 시스템의 슬라이드를 재구성하십시오.

파스퇴르 피펫을 사용하여 각 샘플에 투과화 용액 한두 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 PBS에서 슬라이드를 5분 동안 세척하여 Triton X-100 용액을 세척합니다. 염색 시스템에서 슬라이드를 재배열한 후 각 섹션에 차단 완충액을 한두 방울 떨어뜨려 완전한 커버리지를 보장합니다.

다음으로, 1차 항체와 차단 완충액으로 구성된 1차 항체 혼합물 1mL를 준비합니다. 슬라이드에서 남은 차단 버퍼를 버립니다. 각 절편에 1차 항체 혼합물을 2-3방울 떨어뜨립니다.

배양 후 슬라이드를 수직 랙에 놓고 부드러운 교반을 유지하면서 세척 버퍼에서 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다. 그런 다음, 2차 항체 및 세척 완충액으로 구성된 2차 항체 혼합물 1mL를 준비합니다. 염색 시스템에서 슬라이드를 재배치하고 피펫을 사용하여 2차 항체 혼합물 2-3방울을 각 절편에 분주합니다.

그런 다음 흔들면서 세척 버퍼에서 각각 5분 동안 슬라이드를 세 번 청소합니다. 다음으로, 염색 시스템에 배열된 각 섹션에 Hoechst 33342 용액을 두세 방울 떨어뜨립니다. 슬라이드를 수직 선반에 놓고 부드럽게 저어주면서 세척 버퍼에서 5분 동안 헹굽니다.

각 슬라이드에 형광 장착 매체를 한두 방울 떨어뜨리고 커버 슬립으로 슬라이드를 밀봉합니다. 좌심방의 폐정맥 구멍 영역과 폐정맥 접합부, 폐외정맥 및 폐간정맥을 10배 확대하여 관찰하였다. 폐정맥 구멍, 폐외 정맥 및 폐내 정맥에서 전형적인 근육 줄무늬가 있는 특정 cTnT 신호는 40X 배율로 관찰되었습니다.

Cx43은 3개의 폐 부위 모두에서 발견되었으며 주로 인접한 심근세포 사이에 투영되었습니다. Cx43 관련 신호는 심근 슬리브의 심근 세포의 극측과 측측에서 관찰되었습니다.