시작하려면 다중 채널 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 10밀리몰 시스테인을 멸균 후드에 있는 96웰 플레이트의 웰에 피펫팅합니다. 플레이트를 배양한 후 웰에서 용액을 조심스럽게 흡입하고 전극이 긁히지 않도록 합니다. 멸균 탈 이온수로 우물을 두 번 헹굽니다.
다음으로, 갓 준비한 쥐꼬리 콜라겐 100마이크로리터의 용액을 각 웰에 추가합니다. 저조도에서 한 시간 동안 접시를 잘 배양한 후 탈이온수로 두 번 세척합니다. 다음으로, 채취한 뇌 내피 세포를 새로운 멸균 트로프에 옮깁니다.
멀티채널 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 셀 현탁액을 각 웰에 첨가하여 30초 안에 파종을 완료하고 수학적 모델링 목적으로만 하나의 웰 매체를 보관합니다. 96웰 플레이트 어댑터에서 플레이트를 삽입할 수 있도록 양쪽에 있는 빨간색 클립을 바깥쪽으로 이동합니다. 정확하게, 플레이트의 A 원 웰을 어댑터의 A 원 영역에 맞추고 플레이트 상단에 부드러운 압력을 가하여 제자리에 단단히 고정합니다.
그런 다음 빨간색 클립을 다시 잠급니다. 인큐베이터를 닫은 후 설정을 눌러 기기를 시작하면 올바르게 감지된 모든 웰이 플레이트 맵에 녹색으로 표시됩니다. check 버튼을 눌러 절대 임피던스 판독값을 인증합니다.
이제 플레이트 맵 아래의 드롭다운 메뉴를 사용하여 실험에 사용할 플레이트 유형을 선택합니다. 다양한 교류 주파수에서 임피던스를 측정하려면 다중 주파수를 선택하십시오. 마지막으로 시작 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다.
옴의 증가로 표시되는 고저항 단층이 형성될 때까지 세포가 증식하도록 합니다. 치료 용액을 준비하기 전에 세포 성장이 정체기에 도달했는지 확인하십시오. 처리 용액을 준비하려면 라벨이 부착된 1.1밀리리터 폴리프로필렌 클러스터 튜브를 스트립 튜브 플레이트에 넣습니다.
50 마이크로리터의 처리 사이토카인 또는 세포 3개를 미리 만들어진 플레이트 맵에 따라 튜브에 추가합니다. 그런 다음 따뜻하게 하기 위해 인큐베이터에 넣으십시오. EISs 소프트웨어에서.
일시중지를 클릭하면 진행 중인 실험이 일시적으로 중단됩니다. 메시지가 표시되면 인큐베이터를 열고 플레이트를 안정적으로 유지하면서 두 개의 빨간색 클립을 조심스럽게 풉니다. 실험이 여전히 일시 중지된 상태에서 플레이트를 멸균 후드로 옮깁니다.
그런 다음 인큐베이터에서 치료가 벗겨진 튜브를 제거합니다. 다중 채널 피펫 포함. 치료가 벗겨진 튜브의 내용물을 조심스럽게 재현탁합니다.
이제 스트리핑된 튜브에서 100마이크로리터의 처리물을 피펫팅하여 96웰 플레이트의 적절한 웰로 옮기고 cell-free 웰에는 완전한 매체만 추가합니다. 플레이트를 과도하게 냉각하면 내피 세포 단층의 저항에 영향을 미칠 수 있으므로 5분 이내에 피펫팅을 완료하십시오. 처리된 플레이트를 기계에 다시 부착한 다음 전극 웰 임피던스를 평가하는지 확인하십시오.
올바른 다중 주파수 획득 설정과 플레이트 카탈로그가 선택되었는지 확인합니다. 그런 다음 재개를 눌러 실험을 계속합니다. 실험이 원하는 엔드포인트로 진행되면 finish를 눌러 기록된 파일을 자동으로 저장합니다.
파일로 이동하고 데이터 내보내기를 클릭하여 추가 분석을 위해 데이터를 XLS 또는 CSV 파일로 내보냅니다. 저항성의 증가는 30시간 동안 관찰되었으며, 이는 내피 세포의 성장 단계를 나타냅니다. 성장 단계에서 세포는 48시간까지 서로 다른 수준에서 안정기를 유지했으며, 측정 정규화를 통해 저항 변화를 보다 안정적으로 해석할 수 있었습니다.
치료 전 뇌 내피 세포의 세포 수가 잘못되면 성장 단계가 변동하여 점차 안정적인 저항성 정체기로 감소했습니다. 최적화된 세포 파종 밀도와 로딩 볼륨은 최적의 성장 단계를 가져왔습니다. 사이토카인(cytokine)은 장벽에 일시적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.
흑색종 세포를 추가하면 장벽 저항성이 크게 감소했습니다. 세포주위 장벽과 기저외측 성분은 사이토카인의 추가에 따라 변동했고, 흑색종 세포의 추가는 기저측 성분에 비해 주세포 장벽의 감소 크기가 더 컸습니다.
