시작하려면 클램프 홀더와 금속 클램프를 준비하십시오. 일치하는 cl을 배치amp 하나의 금속 cl이 있는 홀더amp 각각 장착 스테이션에. 금속 cl 위에 젖은 고압 멸균 종이 조각을 놓습니다.amps.
메스로 클램프의 내부 테두리를 따라 종이를 자릅니다. 두 개의 작은 종이 조각을 더 자르고 젖은 상태로 유지하십시오. 뾰족한 핀셋을 사용하여 클램프의 끝점이 있는 금속 클램프 사이의 종이에 8개의 코어 이식을 놓습니다.
코어 외식의 끝점을 더 작은 종이 조각으로 덮고 금속 클램프를 맨 위에 놓습니다. 드라이버와 작은 나사를 사용하여 금속 cl 사이에 코어 이식을 고정합니다.amps와 clamp 홀더. 클램핑된 코어 외식을 실리콘 배양 챔버로 조심스럽게 옮기고 이 챔버를 2mL의 표준 세포 배양 배지로 채웁니다.
그런 다음 추가 나사로 조립품을 고정하십시오. 콜라겐 하이드로겔을 준비하려면 먼저 세포 분리 용액을 사용하여 조직 배양 접시에서 표적 세포를 제거합니다. 그런 다음 실온에서 400G에서 5분 동안 원심분리한 다음 1mL의 표준 배양 배지에 재현탁시킵니다.
다음으로, 10 마이크로 리터의 PBS, 1 몰 NaOH의 1.28 마이크로 리터 및 8.72 마이크로 리터의 이중 증류수를 assembloid당 혼합하여 가교 용액을 제조합니다. 최대 12개의 아셈블로이드의 세포 현탁액을 추가하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 다음과 같은 최종 농도가 달성되도록 셀 현탁액을 조정합니다.
별도로 콜라겐 1 용액을 80 마이크로 리터의 콜라겐을 1 개 첨가하여 조립체 당 1 개씩 준비하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 용액이 얼음 위에서 준비되면 클램핑된 코어 외식이 포함된 챔버에서 세포 배양 배지를 흡인합니다. 가교 용액에 콜라겐 1 용액을 첨가하고 기포를 생성하지 않고 빠르게 피펫팅하여 혼합합니다.
200 마이크로리터의 혼합 용액을 실리콘 챔버의 홈에 추가하여 개별 힘줄 코어 외식을 덮습니다. 하이드로겔을 섭씨 37도에서 50분 동안 중합시킵니다. 그런 다음 실리콘 배양 챔버를 챔버 모서리에 피펫으로 넣어 각 공동 배양 배지 1.5mL로 조심스럽게 채웁니다.
챔버를 인큐베이터에 넣기 전에 큰 페트리 접시 또는 멸균 상자에 넣습니다. 적절한 조건에서 어셈블로이드를 배양하고 배양 배지를 일주일에 두 번 교체합니다. 클램프에서 어셈블리를 가위로 제거합니다.
필요한 경우 핀셋을 사용하여 코어 외식물을 외부 하이드로겔 구획에서 분리합니다. 병변과 유사한 배양 조건에서 집합체를 21일 이상 배양한 결과, 코어 외식물은 기계적으로 신축성이 있고, 외관이 변하지 않았으며, 시각적으로 구별할 수 있고, 주변 하이드로겔과 물리적으로 분리할 수 있는 상태로 유지되는 것이 관찰되었습니다. 또한, 아킬레스건 유래 섬유아세포가 주변 하이드로겔을 가장 빨리 수축하는 파종된 세포 집단에 따라 주변 하이드로겔은 시간이 지남에 따라 압축되었습니다.
3D 콜라겐 하이드로겔의 생존율, 형태 및 세포 확산에 대한 공초점 현미경 평가는 적어도 7일째까지 조립체 배양 중에 생존력이 유지되는 것으로 나타났습니다. 또한, Vegfa 및 Mmps의 유전자 발현은 전사체 분석에 의해 관찰된 바와 같이 코어 외식에서 강하게 증가했다. 마찬가지로, 세크톰 분석은 코어 외식에서 혈관 내피 성장 인자와 같은 사이토카인의 존재를 검출했습니다.
