자웅동체에서 배우자 다발을 채취하고 임질성 산호 종에서 정자를 채취한 후 라벨이 붙은 50밀리리터 튜브에 넣습니다. 4 마이크로리터의 활성 정자 현탁액을 Makler 계수 챔버에 놓습니다. 정자 운동성을 평가하려면 활성화된 샘플의 농도를 추가합니다.
산호 바이오뱅킹 자동 데이터시트 파일을 열고 컴퓨터 보조 정자 분석 평가에 사용되는 정자 희석 계수를 입력합니다. 그런 다음 정자 농도, 총 운동성 및 점진적 운동성에 대한 컴퓨터 지원 정자 분석 출력을 입력합니다. 여과된 정자 샘플 튜브에 정자 농도를 기록하고 튜브를 동결 보존 워크스테이션으로 옮깁니다.
공유된 산호 바이오뱅킹 자동 데이터시트를 열고 냉동 보존 탭을 선택합니다. 정자 샘플 튜브 라벨을 확인한 후 혈청 ID를 확인하여 해당 항목을 식별합니다.혈청학적 피펫을 사용하여 정자 샘플의 부피를 측정하고 동일한 튜브로 다시 배출합니다. E열에 값을 입력합니다. 필요한 동결 보호제 농도에 대해 자동 계산된 열 1을 확인하고 추가할 극저온 보호제 부피에 대해 H열을 확인합니다.
타이머를 시작합니다. 그리고 피펫을 사용하여 샘플을 지속적으로 부드럽게 혼합하면서 극저온 희석제 DMSO를 적가합니다. P열에 cryodiluent edition의 시간을 기록하고 K열을 읽어 충전할 cryo vial의 수를 결정합니다.
멸균 바코드 크라이오 바이알의 뚜껑을 열고 멸균 표면에 캡을 정렬합니다. 혈청학적 피펫과 부분 표본 피펫을 사용하여 1mL의 샘플을 바코드화된 cryo 바이알에 분주하고 리캡 바이알을 재현합니다. 열전대 바이알 1개와 충전된 모든 샘플 바이알을 실온의 빈 cryo rack 인서트에 넣습니다.
그런 다음 여과된 해수에 10%DMSO가 포함된 더미 크라이오 바이알을 크라이오 랙의 빈 슬롯에 넣습니다. 자동 데이터시트의 U열에 실행 번호를 입력하고 크라이오 랙 일련 번호를 V열에 스캔합니다. Z열의 올바른 셀에 커서를 놓고 열전대 바이알을 스캔한 다음 모든 크라이오 바이알 튜브를 스캔합니다. 나머지 동결 보호제 평형을 위해 로드되고 스캔된 랙을 따로 보관하십시오.
cryo rack 냉각 용기에 액체 질소를 분당 약 20°C로 냉각하는 데 필요한 수준까지 채웁니다. 10분의 동결 보호제 평형 기간이 지나면 열전대 프로브를 데이터 로거에 연결하고 기록을 시작합니다. 전체 cryo rack을 냉각 용기에 부드럽게 넣고 뚜껑을 닫습니다.
Q열에 시작 시간을 기록합니다. 열전대 바이알이 데이터 로거에서 섭씨 80도 이하를 가리키면 극저온 랙 인서트를 액체 질소 수조로 옮겨 샘플을 담금질합니다. 랙에서 크라이오 바이알을 제거하고 바이오뱅크로 운송하기 위해 드라이 선적업체로 옮깁니다. Acropora millepora에서 고정 커버 슬립 챔버 슬라이드는 Makler 계수 챔버에 비해 정자 농도 수의 절반 미만을 보여주었습니다.
알려진 농도에서 상업적으로 이용 가능한 라텍스 마이크로비즈로 Makler 계수 챔버를 검증한 결과, 예상 범위 내에서 낮은 변동성으로 일관된 계수가 이루어졌습니다. 20% 또는 30% DMSO를 동결 희석제로 사용하여 냉동 보존된 샘플에서 총정자, 운동성 정자 또는 점진적 운동성 정자의 해동 후 농도에서 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다.
