시작하려면 HEK293T 세포를 10% FBS의 DMEM 고포도당 배지가 포함된 10층 Cell Factory에 시드합니다. 세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 밤새 이산화탄소를 5% 보충합니다. 다음으로, 350밀리리터의 Opti-MEM을 멸균된 500밀리리터 병에 분양합니다.
transfection을 위한 혈장 DNA를 병에 넣고 흔들어 잘 섞습니다. 이제 PEI 용액 15ml를 병에 넣으십시오. 고르게 섞이도록 혼합물을 30초 동안 세게 흔듭니다.
혼합물을 실온에서 15분 동안 배양한 후 1리터 병에 옮깁니다. 그런 다음 700ml의 저포도당 DMEM을 추가합니다. 인큐베이터에서 10층 Cell Factory를 제거하고 배지를 진공 청소기로 진공 청소기로 폐기물 용기에 넣습니다.
DNA transfection 혼합물을 Cell Factory에 조심스럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 Cell Factory를 72-96시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 3-4일 후, 0.45마이크로미터 필터 장치를 통해 정제된 상층액을 여과합니다.
Cell Factory에 DPBS 500ml를 넣어 헹굽니다. 4, 000 g에 4°C에 20 분 동안 그것을 분리하십시오. 진공 시스템과 흡입 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 폐기합니다.
펠릿에 20ml의 AAV 용해 완충액을 첨가하고 혼합하여 펠릿을 완충액에 재현탁시킵니다. 정화할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이제 AAV 용액에 40%PEG 염화나트륨 용액을 추가하여 최종 농도를 최대 8%PEG로 만듭니다.
혼합물을 섭씨 4도에서 밤새 저속 궤도 회전기에 놓습니다. 4에 해결책의 분리기, 바이러스를 침전시키기 위하여 4개의 섭씨 온도에 30 분 동안 000 g. 상층액을 피펫으로 제거합니다.
그런 다음 펠릿에 5 내지 10 밀리리터의 AAV HEPES 재현탁액 완충액을 투여하였다. 현탁액을 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮겨 다운스트림 정제를 계속합니다. 다음으로, 10밀리리터 주사기에 장착된 16게이지 펀트 바늘을 고정하고 준비된 요오딕사놀 구배를 둥글고 폴리프로필렌 초원심분리기 튜브에 오버레이합니다.
22게이지 바늘을 사용하여 그래디언트 위에 최대 17밀리리터의 AAV 용액을 조심스럽게 추가합니다. AAV 투석 완충액으로 튜브를 마무리합니다. 전기 밀봉기로 튜브를 밀봉하십시오.
350, 4 섭씨 온도에 티타늄 회전자에 있는 2 시간 동안 000 g에 관을 분리한다. 그런 다음 초원심분리기 튜브 랙으로 옮깁니다. 이제 새로운 18게이지 바늘을 사용하여 AAV 바이러스를 투석 카세트로 옮깁니다.
카세트에 바이러스를 주입한 후 카세트에서 공기를 제거하십시오. AAV 투석 버퍼가 들어 있는 비커에 교반 막대를 놓고 교반 플레이트에 옮깁니다. 그런 다음 플로트 부표가 있는 완충액에 투석 카세트를 놓습니다.
10밀리리터 주사기를 사용하여 카세트의 바이러스를 원심 필터 장치로 옮깁니다. 4, 4개의 섭씨 온도에 15 30 분 동안 000 g에 분리기. 필터 장치에서 농축된 AAV를 수집합니다.
그런 다음 300마이크로리터의 AAV 투석 버퍼로 필터를 헹굽니다. 마지막으로 헹굼 용액을 농축된 AAV로 옮깁니다. 분리된 AVV 바이러스는 순도가 90% 이상인 것으로 확인되어 in vivo 사용에 적합합니다.
