먼저, 액체 질소에서 3번 통로에서 냉동된 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포가 들어 있는 두 개의 동결 보존 튜브를 회수합니다. 완전히 해동될 때까지 섭씨 37도의 수조에서 저어줍니다. 그런 다음 75% 알코올을 사용하여 튜브를 소독합니다.
소독된 튜브를 매우 깨끗한 테이블 위에 놓습니다. 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 흡입하고 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 250G, 섭씨 4도의 저속 원심분리기에서 튜브를 5분 동안 원심분리합니다.
한편, 10cm 배양 접시 4개를 준비하고 각 접시에 9ml의 배지를 추가합니다. 각 접시에 이름, 세포 유형, 세대 및 실험 날짜를 표시하십시오. 그런 다음 섭씨 37도의 자동 온도 조절 세포 인큐베이터에서 예열합니다.
5분간의 원심분리가 끝나면 원심분리기 튜브를 소독한 후 매우 깨끗한 테이블로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 4ml의 배지를 추가하여 원하는 세포 농도를 얻습니다. 용액이 고르게 분산될 때까지 용액을 부드럽게 저어줍니다.
다음으로, 예열된 각 접시에 1밀리리터의 셀 현탁액을 추가하고 평평한 표면에서 십자형으로 교반하여 흔듭니다. 접시를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣기 전에 광학 현미경으로 40배 배율로 세포를 관찰합니다. 둘째 날에는 교환 매체 준비를 진행하기 전에 40x 배율로 광학 현미경으로 세포 상태를 관찰합니다.
소독 후 배양 접시를 생물 안전 등급 2의 매우 깨끗한 테이블로 옮깁니다. 각 배양 접시에서 배지를 제거합니다. PBS 용액 2ml로 접시를 두 번 부드럽게 헹구고 각 접시에 10ml의 매체를 추가합니다.
상층액 수집을 위해 준비될 때까지 세포를 인큐베이터로 옮깁니다.
