이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82202473)의 일부 지원을 받았습니다.

프로토콜 단계의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 미디어 준비
<ol><li>기초 배양 배지 450mL, 엑소좀이 없는 소 태아 혈청 50mL, 삼중 항생제 5mL를 사용하여 엑소좀이 없는 ADSC용 배양액을 준비합니다.</li>
</ol>2. ADSC의 소생 및 배양
알림: ADSC를 소생시킵니다.
<ol><li>매우 깨끗한 테이블의 자외선을 미리 켜고 30분 동안 소독합니다.</li>
	<li>미리 37°C 수조에서 매체를 예열합니다.</li>
	<li>액체 질소에서 동결된 ADSCs(P2) 튜브 3개를 회수하고 완전히 해동될 때까지 일정한 온도의 37°C 수조에서 교반합니다. 알림: 냉동 튜브의 입구는 오염을 방지하기 위해 물과 접촉하지 않아야 합니다.</li>
	<li>75% 알코올을 사용하여 냉동 보존 튜브를 소독한 다음 매우 깨끗한 테이블로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 흡입하고 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>원심분리기 튜브를 저속 원심분리기에 넣고 4°C에서 5분 동안 250 x g 으로 원심분리합니다.</li>
	<li>10cm 배양 접시 4개를 준비하고 각 접시에 9mL의 배지를 넣습니다. 이름, 세포 유형, 생성 및 실험 날짜를 표시한 다음 37°C 자동 온도 조절 세포 인큐베이터에서 예열합니다.</li>
	<li>원심분리기 튜브를 소독하고 매우 깨끗한 테이블로 옮깁니다. 피펫으로 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>4mL의 배지를 추가하고 용액(1 x 105 cells/mL)이 고르게 분산될 때까지 부드럽게 교반합니다. 알림: 상층액을 추출할 때 세포 펠릿을 제거하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>각 접시에 세포 현탁액 1mL를 추가합니다. 크로스 방식으로 접시를 흔듭니다. 알림: 플레이트를 평평한 표면에 놓고 5-6회 반복 동안 십자형(위, 아래, 왼쪽, 오른쪽으로 이동)으로 교반합니다. 원을 그리는 움직임은 중앙에 세포가 축적될 수 있으므로 피하십시오.</li>
	<li>광학 현미경으로 40x 배율로 세포를 관찰한 다음 접시를 인큐베이터에 넣습니다. 참고: 세포를 관찰하는 주요 목적은 고르지 않은 분포가 후속 성장에 영향을 미치기 때문에 세포가 고르게 분포되어 있는지 확인하는 것입니다.</li>
	<li>세포에 대한 교환 매체를 준비합니다.<ol><li>매우 깨끗한 테이블의 자외선을 미리 켜고 30분 동안 소독합니다.</li>
		<li>미리 37°C 수조에서 매체를 예열합니다.</li>
		<li>광학 현미경으로 40x 배율로 세포 상태를 관찰합니다. 합류 수준은 약 50%입니다. 알림: 합류 수준은 세포가 벽에 부착되어 완전히 늘어난 후 페트리 접시의 표면적에 대한 세포가 차지하는 면적의 비율로 계산됩니다.</li>
		<li>소독 후 배양 접시를 매우 깨끗한 테이블(생물안전 수준 2)로 옮기고 배지를 제거합니다.</li>
		<li>각 배양 접시를 PBS 용액 2mL로 두 번 부드럽게 헹굽니다.</li>
		<li>각 접시에 배지 10mL를 추가합니다. 접시를 인큐베이터로 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ADSC 상층액 수집 및 EV 추출
<ol><li>매우 깨끗한 테이블의 자외선을 미리 켜고 30분 동안 소독합니다.</li>
	<li>현미경으로 세포 상태를 관찰합니다. 합류 수준은 약 80%입니다.</li>
	<li>소독 후 접시를 매우 깨끗한 테이블로 옮깁니다. 피펫으로 상층액을 조심스럽게 모아 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 참고: 셀은 고정하거나 삭제할 수 있습니다. 멸균이 필요하지 않은 경우 수술대에서 다음 단계를 수행할 수 있습니다. 이 시점에서 실험을 일시 중지한 다음 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 실험이 중단된 경우 상층액을 4°C 냉장고에 일주일 이상 보관하지 마십시오. 장기 보관은 EV의 활동에 영향을 줄 수 있으므로 권장하지 않습니다. 최적의 접근 방식은 EV를 즉시 추출하는 것입니다.</li>
	<li>원심분리기(300 x g, 10분, 실온에서)를 사용하여 부유 세포를 제거합니다. 피펫으로 상층액을 수집합니다. 알림: 붓지 마십시오. 펠릿이 빨려 들어가는 것을 방지하기 위해 약간의 상청액을 남겨 두십시오.</li>
	<li>세포 파편을 제거하기 위한 원심분리기(2000 x g, 10분, 4°C)한 다음 피펫으로 상층액을 계속 수집합니다. 참고: 핵심 사항은 3.4단계와 동일합니다.</li>
	<li>0.22um 멤브레인으로 상층액을 여과하여 큰 입자와 세포 파편을 제거합니다. 알림: 여과하기 전에 상층액을 2mL의 멸균 PBS로 여과하여 필터 멤브레인을 적십니다.</li>
	<li>초원심분리기 기계의 원심분리기(10,000 x g, 30분, 4°C).</li>
	<li>다음으로, 1,00,000 x g 에서 4 ° C에서 70 분 동안 원심 분리하여 펠릿을 제거하고 상층액을 수집합니다. 알림: 얻어진 EV는 순도를 높이기 위해 여러 번 원심분리로 정제되었습니다. 펠릿은 육안으로 보이지 않을 수 있습니다. 따라서 피펫을 부드럽게 작동하고 펠릿 수집을 방지하기 위해 바닥에 약간의 상층액을 남겨두는 것이 중요합니다.</li>
	<li>피펫으로 상층액을 제거합니다. PBS 및 원심분리기(1,00,000 x g, 70분, 4°C)로 펠릿을 재현탁합니다. 알림: 펠릿은 육안으로 보이지 않을 수 있습니다. 따라서 피펫으로 상층액을 흡입할 때 EV의 순도를 최대화하기 위해 상층액을 부드럽고 철저하게 제거하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 EV 펠릿을 얻습니다. 1mL의 PBS로 재현탁시키고 1mL 원심분리 튜브에 옮긴 다음 후속 검출을 위해 4°C 냉장고에 보관합니다. 알림: 펠릿은 육안으로 보이지 않을 수 있습니다. 따라서 피펫으로 상층액을 흡입할 때 EV의 순도를 최대화하기 위해 상층액을 부드럽고 철저하게 제거하는 것이 중요합니다. 샘플이 장기간 필요하지 않은 경우 -80 °C 냉장고에 보관하십시오.</li>
</ol>

인간 ADSC에서 세포외 소포체의 초원심분리기 기반 분리(Ultracentrifuge-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Human ADSCs)

<ol>
	<li>Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Looking+forward.">Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464 (2021).</li><li>Xin, H., Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/miRNAs+as+mediating+cell-based+therapy+of+stroke.">Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke.</a> Front Cell Neurosci. 8, 377 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue+origin+effect+of+extracellular+vesicles+on+cartilage+and+bone+regeneration.">The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration.</a> Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).</li><li>Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+adipose+tissue-a+potential+role+in+obesity+and+type+2+diabetes.">Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202 (2017).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+biological+effects+of+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+were+markedly+increased+by+low-intensity+ultrasound+stimulation+for+promoting+diabetic+wound+healing).">Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing).</a> Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).</li><li>Mou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+adipose-derived+stem+cells+for+the+improvement+of+angiogenesis+and+fat-grafting+application.">Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application.</a> Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+bone+immobilized+with+human+adipose+stem+cells-derived+exosomes+promotes+bone+regeneration.">Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).</li><li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+inhibit+the+fibrosis+of+fibrotic+buccal+mucosal+fibroblasts+via+the+microRNA-375/foxf1+axis.">Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis.</a> Stem Cells Int. 2021, 9964159 (2021).</li><li>Brezgin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+aspects+of+manufacturing+and+analytical+control+of+biological+nanoparticles.">Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles.</a> Biotechnol Adv. 64, 108122 (2023).</li><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Character+comparison+of+abdomen-derived+and+eyelid-derived+mesenchymal+stem+cells.">Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells.</a> Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).</li><li>Gan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+improve+liver+fibrosis+by+regulating+the+miR-20a-5p/TGFBR2+axis+to+affect+the+p38+MAPK/NF-&#954;B+pathway.">Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-&#954;B pathway.</a> Cytokine. 172, 156386 (2023).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+and+imaging+of+exosomes+by+transmission+electron+microscopy.">Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (131), e56482 (2018).</li><li>Han, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+exosomes+derived+from+hypoxia-preconditioned+adipose+mesenchymal+stem+cells+promotes+neovascularization+and+graft+survival+in+fat+grafting.">Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).</li><li>Lamparski, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+clinical+grade+exosomes+derived+from+dendritic+cells.">Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).</li><li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+from+blood+plasma:+Qualitative+and+quantitative+comparison+of+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography+methods.">Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extracellular+vesicles+by+three-dimensional+dynamic+culture+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235 (2022).</li><li>Eguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+with+cancer+stem+cell-like+properties+secrete+exosomes+and+HSP90+in+a+3D+nanoenvironment.">Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment.</a> PLoS One. 13 (2), e0191109 (2018).</li></ol>

저자는 선언할 재정적 이해관계가 없습니다.

공식적인 실험 과정에서 최상의 실험 결과를 얻기 위해서는 몇 가지 사항이 중요합니다. 이전 경험에 비추어 볼 때 가능한 최상의 세포 상태를 보장하는 통로 3-6 ADSC를 선택하는 것이 좋습니다. P3 이전에는 적혈구, 내피 세포 및 기타 기타 세포가 스크리닝되지 않았을 수 있습니다. P6 이후에는 세포가 점차 노화될 수 있으며, 이는 분비된 EV의 상태에 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 가능한 한 많은...

대부분의 ADSC는 지방 조직에서 유래하며 심근, 뼈 및 피부를 포함한 다양한 조직과 장기의 재생 및 재건을 촉진하는 것으로 입증되었습니다1. 최근 연구에 따르면 ADSC의 재생 기능은 세포 간 접촉과 세포의 파라크린 효과에 기인할 수 있습니다2. 파라크린 효과는 세포가 짧은 거리에서 상호 작용하고 정보를 전달하는 중요한 수단이며, 이 기능은 세포외 소포체(EV)를 통해 달성됩니다.
EV는 셀에 의해 생성되는 이중층 멤브레인 구조로, 직경이 40nm에서 160nm(평균 약 100nm) 사이입니다. 그들은 사이토카인 생산, 세포 증식, 세포 사멸 및 신진 대사와 같은 다양한 세포 기능에 영향을 미칩니다 3,4. 뼈 재생 촉진, 구강 점막 조직 재생, 조직 이식 후 지방 조직 생존, 피부 상처 복구를 포함한 ADSC EV의 기능에 대한 수많은 연구가 수행되었습니다 5,6,7,8. 재생 의학 분야에서 ADSC EV의 엄청난 잠재력은 분명합니다. 상층액에서 EV를 추출하고 분리하기 위한 다양한 방법이 존재하며, 원심분리, 침전, 분자 크기, 친화도 및 미세유체역학에 기반한 기술과 같은 방법이 있습니다. 초원심분리 방법은EV9를 분리하기 위한 황금 표준으로 널리 간주됩니다. EV 분리를 위한 초원심분리의 기본 원리는 시료의 입자가 다양한 침강 계수를 가지므로 별개의 분리층에서 침강 및 응집이 발생한다는 사실에 기반을 두고 있습니다. 그럼에도 불구하고 초원심분리 중 주의사항을 강조하는 세부 프로토콜은 아직 확립되지 않았습니다.
따라서 본 연구는 ADSC 배양, 상층액 채취 및 EVs 초원심분리 절차 및 요점을 논리적인 정보 흐름과 명확하고 공식적인 언어로 객관적으로 설명합니다. 이는 향후 실험에 대한 귀중한 참고 자료를 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>4652</td>
			<td>0.22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium For Cell Culture</td>
			<td>OriCell</td>
			<td>BHDM-03011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)</td>
			<td>OriCell</td>
			<td>HUXMD-05002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>Lx70-S8F2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Centrifuge</td>
			<td>Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>SC-3612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and characterization of extracellular vesicles from human adipose-derived mesenchymal stem cells

인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC)는 다양한 조직과 장기의 재생 및 재건을 촉진할 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 이들의 재생 기능은 세포 간 접촉 및 세포 측분비 효과에 기인할 수 있습니다. 파라크린 효과는 세포가 짧은 거리에서 상호 작용하고 정보를 전달하는 중요한 방법이며, 여기서 세포외 소포체(EV)는 운반체로서 기능적인 역할을 합니다. 재생 의학 분야에서 ADSC EV는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 여러 연구에서 이러한 방법의 효과에 대해 보고했습니다. EV를 추출하고 분리하는 다양한 방법은 현재 원심분리, 침전, 분자 크기, 친화도 및 미세유체역학과 같은 원리를 기반으로 설명됩니다. 초원심분리는 EV를 분리하기 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 그럼에도 불구하고 초원심분리 중 예방 조치를 강조하기 위한 세심한 프로토콜은 여전히 부재합니다. 이 연구는 ADSC 배양, 상층액 수집 및 EV 초원심분리와 관련된 방법론과 중요한 단계를 제시합니다. 그러나 초원심분리가 비용 효율적이고 추가 치료가 필요하지 않음에도 불구하고 낮은 회수율 및 EV 응집과 같은 몇 가지 불가피한 단점이 여전히 있습니다.

Most ADSCs are derived from adipose tissue and have been demonstrated to promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs, including the myocardium, bone, and skin1. Recent research suggests that the regenerative function of ADSCs may be due to intercellular contact and the paracrine effects of the cells2. The paracrine effect is an important means for cells to interact and transfer information over short distances, and this function is achieved through extracellular vesicles (EVs).
EVs are double-layer membrane structures produced by cells, with a diameter ranging from 40 nm to 160 nm (with an average of about 100 nm). They affect different cellular functions, such as cytokine production, cell proliferation, apoptosis, and metabolism3,4. Numerous studies have been conducted on the functions of ADSC EVs, including promoting bone regeneration, oral mucosal tissue regeneration, adipose tissue survival after tissue transplantation, and skin wound repair5,6,7,8. The enormous potential of ADSC EVs in regenerative medicine is evident. Various methods exist for extracting and separating EVs from the supernatant, such as techniques based on centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. The ultracentrifugation method is widely considered the gold standard for isolating EVs9. The fundamental principle of ultracentrifugation for EV separation is based on the fact that particles in the sample have varying sedimentation coefficients, resulting in their sedimentation and aggregation in distinct separation layers. Nevertheless, a detailed protocol emphasizing precautions during ultracentrifugation has not yet been established.
Therefore, this study objectively outlines the ADSC culture, supernatant collection, and EVs ultracentrifugation procedures and key points with a logical flow of information and clear, formal language. This provides a valuable reference for future experiments.

저자 스포트라이트: 인간 ADSC에서 세포외 소포체의 추출 및 정제 표준화 및 개선

Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells의 세포외 소포체의 정제 및 특성 분석

Our research focuses on the preparation and purification of extracellular vesicles from human adipose-derived mesenchymal stem cells. The problem we want to solve is how to standardize this process and improve the purification efficiency. Currently, there are many technologies used to extract extracellular vesicles, such as ultracentrifugation, ultrafiltration, volume exclusion chromatography, polymer precipitation, immunoaffinity capture, microfluidic technology, and so on.However, ultracentrifugation is recognized as a gold standard, admittedly. In the future, we will focus on the application of extracellular vesicles as vectors, including carrying MRNA, plasmids, and other small molecules and transfecting them into cells.

먼저, ADSC의 형태10 및 표면 항체를 포함하여 ADSC를 특성화하고 식별했습니다. 그림 2A에 따르면 ADSC는 방추 모양으로 배열되어 조밀한 성장 후 소용돌이를 형성하는 것이 분명합니다. 배양된 세포를 지방형성(adipogenic), 골형성(osteogenic) 및 연골형성(chondrogenic) 세포로 분화하고 Oil Red O, Alizarin Red 및 Alcian Blue11로 염색하였다. 유도 분화 실험과...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Standardizing and Improving the Extraction and Purification of Extracellular Vesicles from Human ADSCs at JoVE.com

이 프로토콜은 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC) 배양 및 상층액 수집부터 초원심분리를 사용한 세포외 소포체(EV) 추출에 이르기까지 모든 절차를 설명합니다.

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...

우리의 연구는 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포에서 세포 외 소포체의 준비 및 정제에 중점을 둡니다. 우리가 해결하고자 하는 문제는 이 공정을 표준화하고 정제 효율을 향상시키는 방법입니다. 현재 초원심분리, 한외여과, 부피 배제 크로마토그래피, 고분자 침전, 면역친화성 캡처, 미세유체 기술 등과 같은 세포외 소포체를 추출하는 데 사용되는 많은 기술이 있습니다.그러나 초원심분리는 당연히 황금 표준으로 인정받고 있습니다. 앞으로는 MRNA, 플라스미드 및 기타 소분자를 운반하고 세포에 transfection하는 것을 포함하여 세포외 소포체를 벡터로 적용하는 데 중점을 둘 것입니다.

purification-characterization-extracellular-vesicles-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

387 조회수.  Chinese PLA General Hospital. 우리의 연구는 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포에서 세포 외 소포체의 준비 및 정제에 중점을 둡니다. 우리가 해결하고자 하는 문제는 이 공정을 표준화하고 정제 효율을 향상시키는 방법입니다. 현재 초원심분리, 한외여과, 부피 배제 크로마토그래피, 고분자 침전, 면역친화성 캡처, 미세유체 기술 등과 같은 세포외 소포체를 추출하는 데 사용되는 많은 기술이 있습니다.

비디오: 저자 스포트라이트: 인간 ADSC에서 세포외 소포체의 추출 및 정제 표준화 및 개선

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research suggests that their regenerative function may be attributed to cell-cell contact and cell paracrine effects. The paracrine effect is an important way for cells to interact and transfer information over short distances, in which extracellular vesicles (EVs) play a functional role as carriers. There is significant potential for ADSC EVs in regenerative medicine. Multiple studies have reported on the effectiveness of these methods. Various methods for extracting and isolating EVs are currently described based on principles such as centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. Ultracentrifugation is regarded as the gold standard for isolating EVs. Nevertheless, a meticulous protocol to highlight precautions during ultracentrifugation is still absent. This study presents the methodology and crucial steps involved in ADSC culture, supernatant collection, and EV ultracentrifugation. However, even though ultracentrifugation is cost-effective and requires no further treatment, there are still some inevitable drawbacks, such as a low recovery rate and EV aggregation.

This protocol describes all procedures, from culturing human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) and collecting supernatant to extracting extracellular vesicles (EVs) using ultracentrifugation.

연구

의학

Resuscitation and Culture of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells (ADSCs) for Extracellular Vesicle Extraction

To begin, retrieve two cryopreservation tubes containing frozen human adipose-derived mesenchymal stem cells at passage three from liquid nitrogen. Agitate them in a 37 degree Celsius water bath until fully thawed. Then disinfect the tubes using 75%alcohol.Place the disinfected tubes on an ultra-clean table. Using a pipette, aspirate the cell suspension and transfer it to a 15 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube in a low speed centrifuge at 250 G and four degrees Celsius for five minutes.Meanwhile, prepare four 10-centimeter culture dishes and add nine milliliters of medium to each dish. Mark the name, cell type, generation, and the experiment date on each dish. Then preheat them in a 37 degree Celsius thermostatic cell incubator.Once the five minute centrifugation is over, disinfect the centrifuge tube before moving it to an ultra-clean table. Using a pipette, remove the supernatant and add four milliliters of medium to achieve the desired cell concentration. Gently agitate the solution until it is evenly dispersed.Next, add one milliliter of cell suspension to each preheated dish and shake it by agitating the same on a level surface in a cross pattern. Observe the cells at 40x magnification under an optical microscope before placing the dishes into the 37 degree Celsius incubator. On day two, observe the cell state under the optical microscope at 40x magnification before proceeding for exchange medium preparation.After disinfection, transfer the culture dishes to an ultra-clean table with Biosafety Level 2. Remove the medium from each culture dish. Rinse the dish gently with two milliliters of PBS solution twice and add 10 milliliters of medium to each dish.Transfer the cells to the incubator until they're ready for supernatant collection.

세포외 소포 추출을 위한 지방 유래 중간엽 줄기세포(ADSC)의 소생술 및 배양

Extracting Extracellular Vesicles (EVs) from Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell Culture

To begin, collect the supernatant from the human adipose-derived mesenchymal stem cell culture once the cells are 80%confluent. Collect the supernatant carefully using a pipette and transfer it to a 50 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube at 300 x g for 10 minutes at room temperature to remove suspended cells, then use a pipette to collect the supernatant without disturbing the pellet.Centrifuge the supernatant at 2000 x g for 10 minutes at four degrees Celsius to remove cellular debris. Collect the resultant supernatant with a pipette and filter it through a 0.22 micron membrane to remove large particles and cell debris. Subject the filtrate to ultra centrifugation at 10, 000 x g for 30 minutes at four degrees Celsius.Then perform a final centrifugation at 100, 000 x g for 70 minutes at four degrees Celsius. Using a pipette, remove the supernatant without collecting the pellet. Resuspend the pellet in PBS before centrifuging the tube at 100, 000 x g for 70 minutes at four degrees Celsius.Remove the supernatant and resuspend the obtained pellet of extracellular vesicles, or EVs, in one milliliter of PBS. Finally, transfer the EV suspension to a one milliliter centrifuge tube and store it at four degrees Celsius until further analysis. Transmission electron microscopy clearly revealed the cup-shaped structure of the EVs with a bilayer membrane.Nanoparticle tracking analysis indicated that they have a particle size distribution of around 50 to 150 nanometers. Western blot analysis showed that the characteristic marker proteins of EVs were expressed smoothly.