시작하려면 사전 데워진 이미징 매체와 코팅 또는 코팅되지 않은 커버 유리 표면이 있는 멸균 현미경 접시를 작업 플랫폼에 놓습니다. 아가로스 몰드를 둘러싼 매체를 제거한 후 부유 스페로이드를 2밀리리터 바이알로 옮기기 전에 190마이크로리터 매체에 몰드의 내용물을 조심스럽게 재현탁합니다. 저부착 플레이트에 있는 스페로이드의 경우, 개별 웰에서 바이알로 스페로이드를 하나씩 옮깁니다.
스페로이드가 바이알 바닥에 5분 동안 가라앉아 눈에 보이는 펠릿을 형성하도록 합니다. 스페로이드를 방해하지 않고 바이알에서 매체를 제거하고 충분한 양의 새 McCoy's 5A 배지에 부드럽게 재현탁합니다. 이제 현미경 접시의 웰당 동일한 부피의 스페로이드 현탁액을 옮깁니다.
이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 스페로이드를 배양합니다. 알려진 부피의 스페로이드 현탁액에 형광 프로브를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양을 계속합니다. 배양 후 형광 프로브가 들어있는 매체를 필요한 양의 이미징 매체와 교환합니다.
현미경 제어 소프트웨어를 시작하고 stage 보정을 초기화합니다. 그런 다음 필요한 목표를 선택합니다. 프로젝트 열기 창을 선택하고 새 프로젝트 만들기를 클릭합니다.
그런 다음 새로 생성된 프로젝트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 이름 바꾸기 옵션을 선택합니다. 연구 프로젝트 파일에 표준 이름을 지정합니다. 획득 창을 엽니다.
펄스, 백색광, 레이저 여기 파장, 필요한 하이브리드 또는 공명 스캐닝 검출기 범위를 설정합니다. 그런 다음 스캔할 라인 또는 프레임 유형을 선택합니다. Acquisition 창에서 FLIM 모드를 선택하여 광자 계수와 결합된 이미징을 수행합니다.
그런 다음 백색광 레이저 펄스 반복률을 선택합니다. Fast Live 모드를 사용하여 미리보기 이미징을 시작하고 관심 영역에서 이미징 개체의 미세한 초점을 조정합니다. 픽셀 강도 히스토그램을 보고 적절한 레이저 강도 핀홀 크기와 해상도를 조정합니다.
Fast Live에서 좌표와 스캔 방향을 설정하고 Z-Stack 창에서 시작하고 끝나도록 지정합니다. z-스텝 크기 또는 스텝 수를 선택합니다. 필요한 모든 설정이 적용되면 이미징을 시작합니다.
이미지에 적절한 이름을 지정하고 이미징 프로젝트를 저장합니다. 다양한 형성 방법으로 인해 다양한 스페로이드 크기가 생성되었습니다. low attachment plate의 HCT116 스페로이드는 고처리량 방법에 비해 5일 후에 훨씬 더 컸습니다.
낮은 부착 방법은 프로피듐 요오드화물 염색에 의해 감지된 괴사 코어의 명백한 발달로 이어졌습니다. 대조적으로, 다른 방법으로 생성된 스페로이드는 스페로이드체 전체에 걸쳐 죽은 세포의 확산 분포를 보여주었습니다. 다양한 방법으로 생산된 HCT116 스페로이드의 산소화는 Sphericalplate 5D보다 미세조직 및 실험실에서 만든 마이크로몰드에서 더 많은 산소가 함유된 스페로이드를 보여주었습니다.
Sphericalplate 5D 스페로이드의 스페로이드 산소화는 미세조직 및 실험실에서 만든 마이크로몰드에 비해 산소화가 더 낮았습니다. 저부착판을 사용하여 만든 HCT116 스페로이드의 페이저 분석은 이광자 NADPH-FLIM을 통해 해당과정(glycolytic core)과 비해당과정(non-glycolytic core)의 존재를 보여줍니다.
