이 연구는 겐트 대학의 특별 연구 기금(BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), 연구 재단 플랑드르(FWO, I001922N) 및 유럽 연합, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN No. 101073507.

FLIM 기반 대사 및 저산소증 분석을 위한 다세포 스페로이드 형성

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다세포 스페로이드는 종양 및 줄기세포 틈새 미세환경, 약물 발견 및 생체 제조를 위한 '조직 구성 요소' 개발 연구에서 선택되는 방법이 되고 있습니다. 스페로이드의 이질적인 내부 구조, 영양소의 기울기 및 산소화는 상대적으로 간단하고 접근하기 쉬운 환경에서 생체 내 조직 및 종양의 이를 모방할 수 있습니다. 더 많은 방법론적 투명성26,28 ...

다세포 스페로이드는 세포의 자체 응집에 의해 얻어지고 구형을 나타내는 3D 조직 모델 그룹을 나타냅니다. 체외에서 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 모방하고 다수의 암 및 줄기 세포 유래 구조 내에서 3D 컨텍스트를 재현하는 데 널리 사용됩니다. 세포 부착을 줄이고 응집을 촉진하기 위해 몇 가지 기술이 사용됩니다. 여기에는 표면 장력1에 의존하는 행잉 드롭 방법이 포함됩니다. 초저 부착 플레이트, 마이크로 몰드 및 마이크로 웰과 같은 세포 부착 방지 방법 2,3; 음향 파동 기반 접근법4; 흐름 유도 응집 방법(스피너 플라스크, 생물 반응기 및 미세유체 장치)5; 자기 입자 보조 형성6 및 응집 촉진 합성 및 ECM 기반 매트릭스 및 스캐폴드의 사용 7,8,9.
암 연구, 개발 및 신약 요법의 검증에서 스페로이드는 영양분, 폐기물 및 O2 의 공간 확산 제한 구배를 요약 할 수있는 능력으로 인해 매력적인 모델이며, 종종 고형 종양10,11에 전형적인 괴사 코어의 형성으로 이어집니다. 이처럼 보다 신뢰할 수 있고 정교한 체외 모델은 동물 연구(대체, 환원 및 정제)의 3R 원칙에 따라 동물 모델의 광범위한 사용(미국 식품의약국(FDA) 현대화법 2.0,12)에 대한 필요성에 도전합니다. 암 외에도 스페로이드는 줄기 세포 연구에 응용되고 있습니다. 예를 들어, 만능줄기세포는 배아체(EB)를 형성할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이는 유도만능줄기세포(iPSC)를 신경 전구세포(neural precursor cells)13 또는 난소 과립세포(ovarian granulosa cells)13,14와 같이 환자로부터 직접 얻기 어려운 특수 세포 유형으로 분화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, EB의 형성은 종종 더 복잡한 오가노이드 모델, 예를 들어 신경15, 망막16, 심장17, 간18, 위19 및 장 오가노이드20의 개발에서 첫 번째 단계입니다. 크기, 재현성, 처리량 및 다운스트림 응용 분야를 포함한 요소는 실험에 적합한 스페로이드 형성 방법을 선택할 때 고려해야 합니다.
3D 문화의 복잡성이 증가하면 2D 문화에 비해 변동성이 커질 수 있습니다. 영양 조성(21), 매체 증발(22), 점도(23), pH 조절(24), 스페로이드 형성 방법 및 배양 시간 (25,26)과 같은 요인은 다양한 형태, 크기, 생존도 및 다른 화학 저항 성(27,28)을 얻을 수 있습니다 . 최근 연구에 따르면 스페로이드 산소 구배가 항상 정적인 것은 아니며 형성 방법, 스페로이드 크기 및 세포외 점도에 의해 영향을 받아 스페로이드 이질성에 영향을 미친다는 것이 입증되었습니다29. 스페로이드에 대한 재현성 및 데이터 접근성을 개선하기 위해 MISpheroID 지식 기반이 개발되었으며26, 세포주, 배양 배지, 형성 방법 및 스페로이드 크기를 재현성 있는 결과를 위한 최소 정보로 식별합니다. 따라서 웰 크기(최대 스페로이드 크기 추정치 제공), 사용된 소모품, 준비 시간 및 스페로이드를 현미경 접시로 운반하지 않고 모니터링할 수 있는 가능성을 포함하여 여러 고처리량(SphericalPlate 5D, 실험실에서 제작한 마이크로몰드 및 마이크로티슈 몰드)과 저부착 방법(즉, Biofloat 및 Lipidure-coated 96-well plate, 스캐폴드가 없는 플레이트 및 스캐폴드 기반)에 대한 자세한 비교가 이루어졌습니다(그림 1 및 표 1). 후자는 장기 연구를 가능하게 하는 반면, 고처리량 방법으로 생산된 스페로이드는 종종 종말점 실험으로 이어집니다. 5DspheriPlate의 그리드를 제외한 모든 방법은 원치 않는 자가형광을 가져오지 않으므로 현미경 검사에서 직접 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> 그림 1: 스페로이드 형성 방법 설명. 플레이트에 특허받은 마이크로웰을 통합한 SphericalPlate 5D와 같은 고처리량 방법, 실험실에서 생산한 마이크로몰드 및 마이크로티슈 몰드는 스탬프를 사용하여 아가로스(파란색)로 여러 마이크로웰을 만듭니다. Lipidure(Amsbio) 및 Biofloat(Sarstedt)와 같은 저부착 플레이트는 세포 표면 접착을 억제하고 세포 자기 응집을 촉진하는 비접착 코팅을 사용합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>5D 스페리플레이트</td>
			<td>자체 생산 마이크로몰드</td>
			<td>미세조직</td>
			<td>낮은 부착 방법</td>
		</tr><tr><td>스페로이드/웰의 수</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>지름 웰</td>
			<td>90 마이크로미터</td>
			<td>400 마이크로미터</td>
			<td>800 마이크로미터</td>
			<td>1의 mm</td>
		</tr><tr><td>배양량</td>
			<td>1mL</td>
			<td>5mL</td>
			<td>1mL</td>
			<td>200 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>다른 소모품</td>
			<td>/</td>
			<td>3% 아가로스 7mL</td>
			<td>500μL의 2% 아가로스</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>준비 시간</td>
			<td>10분</td>
			<td>2시간 + 3일 미디어 적응</td>
			<td>0.5시간 + 15분 미디어 적응</td>
			<td>10–30분 + 1시간 건조</td>
		</tr><tr><td>모니터링</td>
			<td>예</td>
			<td>아니요**</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td>자가형광등</td>
			<td>예</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
		</tr><tr><td>재사용할 수 있는</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>아니요**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">비용</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: 코팅 및 재료</td>
		</tr><tr><td>€€: 상업용 96웰 플레이트</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*일부 세포주는 소형 스페로이드를 형성하기 위해 ECM(즉, 2%–5% Matrigel)을 추가해야 합니다.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**코팅은 고갈될 때까지 재사용할 수 있습니다. 그러나 각 플레이트는 소량의 매체를 소비하고 시간이 지남에 따라 먼지가 쌓일 수 있습니다. 필터 멸균은 정기적으로 필요합니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 다중 스페로이드 형성 방법 비교29. "모니터링": 현미경 접시로 옮길 필요 없이 스페로이드를 모니터링할 수 있는 기능. 0-50유로, 50-150유로, 150-500>유로, 500유로
형광 현미경 검사를 사용하면 세포 사멸, 생존력, 증식, 대사, 점도 및 기계적 특성을 포함한 스페로이드 내의 주요 생물학적 측면을 직접 모니터링할 수 있습니다30. 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)은 (미세) 환경(31,32,33,34) 내에서 형광 프로브 상호 작용을 연구하기 위한 추가적인 정량적 차원을 제공하여 서로 다른 방출 수명(35,36)에 따라 중첩 방출 스펙트럼을 해결할 수 있습니다 그리고 intrinsic cellular autofluorescence에 기반한 세포 대사를 조사합니다. 따라서 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NAD(P)H), 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD), 프로토포르피린 IX 등과 같은 광범위한 세포 자가형광 화합물은 1광자 및 2광자 FLIM으로 측정할 수 있으며 포도당 이화작용, 산화적 인산화(OxPhos)의 고유한 '센서' 역할을 하며 세포 산화 환원 상태에 대한 일반적인 개요를 제공합니다. NAD(P)H는 유리 세포질 또는 단백질 결합 미토콘드리아 형태37,38에 존재합니다. 유사하게, FAD의 산화 된 상태는 자유 형태의 수명이 더 긴 형광성입니다. NAD(P)H 및 FAD 현미경은 일반적으로 시료 광손상을 방지하는 것을 목표로 하는 2광자 여기 FLIM을 사용합니다39. 스페로이드 또는 오가노이드 대사, 산소화, 증식 및 세포 생존율에 대한 보다 완전한 그림을 제공하기 위해 '광학 대사 이미징' FLIM을 염료 기반 프로브, 유전적으로 인코딩된 바이오센서, 인광 수명 이미징 현미경(PLIM) 및 비율계량 강도 기반 측정과 결합할 수 있습니다 29,30,31. 또한 FLIM은 Förster 공명 에너지 전달(FRET) 방법과 결합하여 수용체와 밀접하게 접촉할 때 공여체 형광단의 수명 변동을 측정하여 표적 도메인 33,40,41과 약물의 결합을 조사할 수 있습니다.
획득된 FLIM 이미지는 일반적으로 픽셀 단위로 수명을 계산하기 위해 분석됩니다. 현재 형광 수명을 얻기 위해 사용되는 최소 3가지 일반적인 전략이 있습니다: 반정량적 'fast FLIM'42('tau sense'43,44라고도 함), 1, 2 또는 3 지수 피팅을 사용하는 감쇠 곡선 피팅, 페이저 변환 및 페이저 플롯 분석을 통한 '피팅이 없는' 접근 방식입니다. 공급업체에 따라 제공된 소프트웨어(LAS X, Symphotime, SPCImage 등) 또는 오픈 소스 소프트웨어(예: FLIMfit45, FLIMJ46 또는 기타(47))를 사용하여 측정된 FLIM 데이터를 처리할 수 있습니다. 일반적으로 공급업체에서 제공하는 소프트웨어는 예비 데이터 분석에 유용하며, 오픈 소스 솔루션은 페이저 플롯 및 3D 시각화 등을 사용하여 보다 정확한 연구를 제공할 수 있습니다.
스페로이드를 연구하는 방법으로서 FLIM의 유용성과 매력에도 불구하고 사용할 수 있는 실험 프로토콜은 거의 없으며 FLIM과 관련된 성공적인 라이브 다중 파라메트릭 현미경 실험을 위해 가장 적합한 형성 방법을 선택하는 데 일반적으로 지식이 부족합니다. 여기에서는 일반적으로 사용되는 스페로이드 형성 프로토콜의 형태, 생존력 및 산소화를 기반으로 최근에 검증되고 특성화된 원적외선 및 근적외선(NIR) 산소 감지 나노센서(MMIR1)를 기반으로 자세히 비교합니다. 양이온성 나노입자는 두 개의 리포터 염료, 즉 기준 O2-민감하지 않은 aza-BODIPY(여기 650nm, 방출 675nm)와 NIR O2-민감성 메탈로포르피린, PtTPTBPF(여기 620nm, 방출 760nm)로 함침됩니다. MMIR1을 사용하면 세포 독성을 유발하지 않고 기존 형광 현미경(비율계량 분석 사용) 또는 인광 수명 현미경(PLIM)에서 산소 구배를 실시간으로 분석할 수 있으며 안정적인 신호, 장기 모니터링 및 다중화가 가능합니다25,29. 염료 또는 나노센서로 염색해야 하는 필요성, 스페로이드 처리량 또는 세포 유형에 따라 가장 적합한 형성 프로토콜을 선택할 수 있습니다. 스페로이드 생존력 및 산소화에 대한 연구는 암 및 줄기세포 유래 스페로이드 연구와 관련이 있기 때문에 제시된 프로토콜에는 이러한 모델에서 NAD(P)H-FLIM 및 FAD-FLIM의 예와 예상되는 일반적인 결과도 포함됩니다. 제시된 이미징 및 분석 파이프라인은 가장 인기 있는 시간 상관 단일 광자 계수 기반 FLIM 현미경 플랫폼을 대상으로 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Also available from Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-3700</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well cell-culture plates, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>665-180</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Chamber slide, removable</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81201</td>
			<td>Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nerbe plus</td>
			<td>02-502-3001</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Petri Dish micromolds</td>
			<td>Microtissue</td>
			<td>Z764000-6EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell-culture plates, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL02.0537.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biofloat</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3925.400</td>
			<td>Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein Green-AM</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>AS-89201</td>
			<td>Apply in dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>version 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from human placenta, type IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal FLIM Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td>Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030-10X1L</td>
			<td>For preparation of imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;(FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-098</td>
			<td>Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colon cancer cells HCT116</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>version 1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>version 4.6.1.27508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure-CM5206</td>
			<td>Amsbio</td>
			<td>AMS.52000034GB1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>392-0420</td>
			<td>Standard growth medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-patterned 3D-printed PDMS stamps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chemlab</td>
			<td>CL00.1429.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer couting chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15980396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 probes: MMIR1</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 
			v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>Gibco18912014</td>
			<td>Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 &#956;g/mL) 100x solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5mg</td>
			<td>For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25535-16-4</td>
			<td>Cell death staining, use 1 &#181;g/mL at 1h incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A35149</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphericalPlate 5D 24-well</td>
			<td>Kugelmeiers</td>
			<td>SP5D-24W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile petridish</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>633181</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (25 cm&#178; )</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2311</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (75 cm&#178;)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Agarose</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and multi-parameter live cell fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) of multicellular spheroids

다세포 종양 스페로이드는 종양 미세환경을 재현하고, 약물 요법을 테스트 및 최적화하고, 3D 컨텍스트에서 바이오 및 나노 센서를 사용하기 위해 널리 사용되는 3D 조직 미세응집 모델입니다. 생산 용이성, 예측 가능한 크기, 성장, 관찰된 영양소 및 대사 산물 구배는 3D 틈새와 같은 세포 미세환경을 요약하는 데 중요합니다. 그러나 스페로이드 이질성과 생산 방법의 가변성은 전반적인 세포 대사, 생존력 및 약물 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 이로 인해 크기, 가변성, 생체 제조 요구 사항, 줄기 세포 및 암세포 생물학에서 체외 3D 조직 모델로 사용하는 요구 사항을 고려할 때 가장 적합한 방법론을 선택하기가 어렵습니다. 특히, 스페로이드 생산은 광학 대사 이미징, 형광 수명 이미징 현미경(FLIM), 나노 센서를 사용한 스페로이드 저산소증 모니터링 또는 생존력과 같은 정량적 라이브 현미경과의 호환성에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에는 여러 가지 기존의 스페로이드 형성 프로토콜이 제시되어 실시간 광시야, 공초점 및 이광자 현미경과의 호환성을 강조합니다. 다양한 유형의 암 및 줄기세포 스페로이드를 사용하는 다중 자가형광 FLIM을 사용한 후속 이미징에서 분석 파이프라인에 대한 후속 이미징도 제시됩니다.

Multicellular spheroids represent a group of 3D tissue models obtained by the self-aggregation of cells and exhibiting a spherical shape. They are widely used to mimic cell-cell and cell-matrix interaction in vitro and to reproduce&#160;a 3D context within a multitude of cancer and stem cell-derived constructs. Several techniques are employed to reduce cell attachment and promote the aggregation. These include the hanging-drop method relying on the surface tension1; cell attachment repelling methods such as ultra-low attachment plates, micro-molds, and microwells2,3; acoustic wave-based approach4; flow-induced aggregation methods (spinner flasks, bioreactor, and microfluidic devices)5; magnetic particles-assisted formation6 and use of the aggregation-promoting synthetic and ECM-based matrices and scaffolds7,8,9.
In cancer research, development, and validation of new drug therapies, spheroids are an attractive model due to their ability to recapitulate the spatial diffusion-limited gradients of nutrients, waste products, and O2, often leading to the formation of a necrotic core, typical to the solid tumors10,11. These more reliable and sophisticated in vitro models challenge the need for extensive use of animal models (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), according to the 3Rs principle of animal research (replacement, reduction, and refinement). In addition to cancer, spheroids find their application in stem cell research. For instance, pluripotent stem cells have the capacity to form embryoid bodies (EB), which can be used for the differentiation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) towards specialized cell types that are challenging to obtain directly from patients, such as neural precursor cells13 or ovarian granulosa cells13,14. Furthermore, the formation of an EB is often the first step in the development of more complex organoid models, e.g., neural15, retinal16, cardiac17, liver18, stomach19, and intestinal organoids20. Factors including size, reproducibility, throughput, and downstream applications should be considered when choosing an appropriate spheroid formation method for the experiments.
The increased complexity of 3D culture can lead to higher variability compared to 2D culture. Factors such as nutrient composition21, media evaporation22, viscosity23, pH control24, spheroid formation method, and even the time in the culture25,26 can result in obtaining spheroids of varying morphology, sizes, viability, and different chemoresistance27,28. Recent research demonstrated that spheroid oxygen gradients are not always static and are affected by the formation method, spheroid size, and extracellular viscosity, affecting the spheroid heterogeneity29. To improve reproducibility and data accessibility on spheroids, the MISpheroID knowledge base has been developed26, identifying cell line, culture medium, formation method, and spheroids size as the minimal information for a reproducible result. Therefore, a detailed comparison was made of multiple high-throughput (SphericalPlate 5D, lab-made micromolds, and Microtissue molds) and low attachment methods (i.e., Biofloat and Lipidure-coated 96-well plates, both scaffold-free and scaffold-based) (Figure 1 and Table 1), including the well size (given an estimation of the maximum spheroid size), consumables used, preparation time and the possibility of monitoring spheroids without transporting them to microscopy dishes. The latter enables long-term studies, whereas spheroids produced with high-throughput methods often result in endpoint experiments. All methods except for the grids of the 5DspheriPlate do not bring unwanted autofluorescence, hereby enabling their direct use in microscopy.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg" /> 
Figure 1: Spheroid formation methods explained. High-throughput methods such as the SphericalPlate 5D, which has integrated patented microwells in the plate, while the lab-produced micromolds and the MicroTissue molds use stamps to make multiple microwells in agarose (blue). Low-attachment plates such as Lipidure (Amsbio) and Biofloat (Sarstedt) use a non-adherent coating inhibiting cell-surface adhesion and promoting cell self-aggregation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>5D SpheriPlate</td>
			<td>Self-produced micromolds</td>
			<td>Microtissue</td>
			<td>Low attachment methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number of spheroids/well&#160;</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diameter well</td>
			<td>90 &#181;m</td>
			<td>400 &#181;m</td>
			<td>800 &#181;m</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture volume</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other consumables</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL of 3% agarose</td>
			<td>500 &#181;L of 2% agarose</td>
			<td>/ *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation time</td>
			<td>10 min</td>
			<td>2 h + 3 days media adaptation</td>
			<td>0.5 h + 15 min media adaptation</td>
			<td>10&#8211;30 min + 1 h drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No**</td>
			<td>Yes</td>
			<td>Yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescent</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable</td>
			<td>No</td>
			<td>Yes</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Cost</td>
			<td rowspan="2">&#8364;&#8364;&#160;</td>
			<td rowspan="2">&#8364;</td>
			<td rowspan="2">&#8364;&#8364;&#8364;&#8364;</td>
			<td>&#8364;&#8364;&#8364;&#8364;: Coating and Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8364;&#8364;: Commercial 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*Some cell lines need addition of&#160; ECM (i.e. 2%&#8211;5% Matrigel) to form compact spheroids.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">**The coating is reusable until depleted. However, each plate will consume a small amount of media and dust can accumulate over time. Filter sterilization is regularly needed.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Comparison of multiple spheroid formation methods29. &#34;Monitoring&#34;: the ability to monitor spheroid without the need for transfer to a microscopy dish. &#8364;: 0-50&#8364;, &#8364;&#8364;: 50-150&#8364; , &#8364;&#8364;&#8364;: 150-500&#8364; , &#8364;&#8364;&#8364;&#8364;: &#62;500&#8364;
Fluorescence microscopy enables direct monitoring of the key biological aspects within spheroids, including cell death, viability, proliferation, metabolism, viscosity, and even mechanical properties30. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) provides an additional quantitative dimension for studying fluorescent probe interactions within their (micro)environment31,32,33,34, allowing resolving the overlapping emission spectra according to different emission lifetimes35,36 and probing cell metabolism based on intrinsic cellular autofluorescence. Thus, such widespread cellular autofluorescent compounds as nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H), flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD), protoporphyrin IX, and others can be measured with one- and two-photon FLIM and serve as intrinsic &#39;sensors&#39; of glucose catabolism, oxidative phosphorylation (OxPhos) and provide a general overview of the cell redox state. NAD(P)H exists in free cytoplasmic, or in protein-bound mitochondrial forms37,38. Similarly, the oxidized state of FAD is fluorescent with a longer lifetime of the free form. NAD(P)H and FAD microscopies usually involve two-photon excited FLIM, aiming at preventing sample photodamage39. Frequently, &#39;optical metabolic imaging&#39; FLIM can be combined with the use of dye-based probes, genetically encoded biosensors, phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM), and ratiometric intensity-based measurements in order to provide a more complete picture of spheroid or organoid metabolism, oxygenation, proliferation and cell viability29,30,31. In addition, FLIM can also be combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) method to measure the lifetime variation of the donor fluorophore when in close contact with the acceptor to investigate the binding of a drug with its target domain33,40,41.
The acquired FLIM images are typically analyzed to calculate the lifetime pixel-by-pixel. Currently, there are at least 3 common strategies used to obtain fluorescence lifetime: semi-quantitative &#39;fast FLIM&#39;42 (sometimes referred to as &#39;tau sense&#39;43,44), decay curve fitting, using one-, two- or three-exponential fitting, and &#39;fitting-free&#39; approach with phasor transformation and phasor plot analysis. Depending on the vendor, either provided (LAS X, Symphotime, SPCImage, etc.) or open-source software (e.g., FLIMfit45, FLIMJ46, or others47) can be used to handle measured FLIM data. Typically, vendor-provided software is useful for preliminary data analysis, while open-source solutions can provide for more accurate studies using, e.g., phasor plots and 3D visualization.
Despite the usefulness and attractiveness of FLIM as a method for studying spheroids, very few experimental protocols are available, and there is a general lack of knowledge in choosing the most appropriate formation method for successful live multiparametric microscopy experiments involving FLIM. Here, a detailed comparison of commonly used spheroid formation protocols is presented based on their morphology, viability, and oxygenation with the recently validated and characterized far-red and near-infra-red (NIR) oxygen-sensing nanosensor (MMIR1). The cationic nanoparticle is impregnated with two reporter dyes, the reference O2-insensitive aza-BODIPY (excitation 650 nm, emission 675 nm) and the NIR O2-sensitive metalloporphyrin, PtTPTBPF (excitation 620 nm, emission 760 nm). The MMIR1 enables real-time analysis of oxygen gradients on a conventional fluorescence microscope (using ratiometric analysis) or phosphorescence lifetime microscope (PLIM) without introducing cellular toxicity and allowing for stable signals, long-term monitoring, and multiplexing25,29. Depending on the need to stain with dyes or nanosensors, spheroid throughput, or cell type, the most appropriate formation protocol can be chosen. Since the studies of spheroids viability and oxygenation are relevant for studies of cancer and stem cell-derived spheroids, the presented protocols also include examples and expected typical results of NAD(P)H-FLIM and&#160;FAD-FLIM with these models. The presented imaging and analysis pipelines target the most popular time-correlated single photon counting-based FLIM microscopy platforms.

저자 스포트라이트: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 대사 및 산소화 분석을 위한 스페로이드 형성 방법 표준화

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

In this work, we present and compare spheroid formation methods that can be used for analysis of cell metabolism and oxygen distribution using live cell microscopy. In recent years, fluorescence lifetime imaging microscopy has been extensively used to investigate metabolic biomarkers like NADPH and FAD in live cells, and several fluorescent nanoparticles have been developed to multiplex such measurements with imaging of cell and tissue oxygenation. Multicellular spheroids, organoids, and organ-on-a-chip can replicate a complex, in-vivo-like microenvironment, minimizing the need in animal research.For spheroid production, we show different formation methods, can span from low to high throughput. They also highlight their optical accessibility, compatibility with fluorescence lifetime imaging microscope, and the possibility of including extracellular matrix components. So, even though 3D in vitro models provide better context in comparison to 2D cultures, their high variability, low reproducibility, and incomplete experimental reporting remain a problem.Parameters such as the spheroid size, the nutrient composition, the extracellular viscosity, and even spheroid formation methods can all lead to increased cellular heterogeneity. With this protocol, we aim to harmonize and standardize the spheroid production methods, highlighting key aspects important for life-continuous and multiparametric analysis of spheroids using FLIM microscopy.

적절한 스페로이드 형성 방법 선택 선택한 스페로이드 형성 방법은 스페로이드의 크기, 모양, 세포 밀도, 생존력 및 약물 민감성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다(그림 2). 이전에는 여러 고처리량(SphericalPlate 5D, 실험실에서 만든 마이크로몰드 및 MicroTissue 몰드)과 '중간 처리량' 저부착(Biofloat 및 Lipidure-coated 96-well 플레이트) 방법의 효과를 스페로이드 생존력 및 ?...

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

production-multi-parameter-live-cell-fluorescence-lifetime-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

496 조회수.  Ghent University. 본 연구에서는 생세포 현미경을 이용하여 세포 대사 및 산소 분포를 분석할 수 있는 스페로이드 형성 방법을 제시하고 비교합니다. 최근 몇 년 동안 형광 수명 이미징 현미경은 살아있는 세포에서 NADPH 및 FAD와 같은 대사 바이오마커를 조사하는 데 광범위하게 사용되었으며, 세포 및 조직 산소화의 이미징과 함께 이러한 측정을 다중화하기 위해 여러...

비디오: 저자 스포트라이트: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 대사 및 산소화 분석을 위한 스페로이드 형성 방법 표준화

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

연구

생체공학

High-Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging

To cast 3D Petri dishes, rinse the micromolds in distilled water and place them in an autoclavable container for autoclaving. Add 0.9%sterile saline to the autoclave agarose powder in a 200 milliliter glass bottle. Screw on the lid loosely to avoid pressure buildup and swirl the bottle to mix the agarose powder.Boil the agarose powder in a microwave oven with intermittent shaking. Once the agarose solution is cooled down, pipette the molten agarose into the micro mold and wait until it solidifies. Afterward, carefully flex the micro mold to remove the 3D Petri dish and transfer it to a 12-well tissue culture plate.To equilibrate the 3D Petri dish, add 2.5 milliliters of McCoy's 5A medium per well, and incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After the final equilibration, completely remove all culture medium surrounding the 3D Petri dish and inside of the dish. Dropwise, seed 190 microliters of cell suspension containing 40, 500 cells into the seeding chamber and allow the cells to settle for 10 minutes.Add two milliliters of McCoy's 5A medium to the outside of the 3D Petri dish, and incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After four days, the spheroids are compact enough for microscopy. Add 200 microliters of the coating solution to each well of a 96-well U-bottom culture plate, and incubate for one minute.Remove the excess coating solution and allow the plate to dry for one hour. See 200 microliters of cell suspension containing 500 cells to each well and incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for at least four days.

Live 3D Imaging을 위한 인간 암 세포주에서 다세포 스페로이드의 고처리량 생성

Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

To begin, place the prewarmed imaging medium and sterile microscopy dishes with coated or non-coated cover glass surfaces on a working platform. After removing the medium surrounding the agarose mold, carefully resuspend the content of the molds in 190 microliters media before transferring floating spheroids into a two milliliter vial. For spheroids in a low-attachment plate, transfer spheroids one by one from individual wells to a vial.Allow the spheroids to settle down at the bottom of the vial for five minutes, forming a visible pellet. Remove the media from the vial, leaving spheroids undisturbed, and gently resuspend them in a sufficient amount of fresh McCoy's 5A medium. Now, transfer an equal volume of spheroid suspension per well of the microscopy dish.Incubate spheroid for 1 to 2 hours at 37 degrees Celsius in a carbon dioxide incubator. Add a fluorescence probe to a known volume of spheroid suspension and continue incubation for 1 hour at 37 degrees Celsius. After incubation, exchange the media containing fluorescent probes with a necessary volume of imaging media.Start the microscope control software and initialize the stage calibration. Then, choose the required objective. Choose the Open project window and click Create a New Project.Then, right click on the newly created project and select the Rename option in the dropdown menu. Give a standard name to the research project file. Open the Acquisition window.Set the pulse white light laser excitation wavelength and the required range of hybrid or resonance scanning detectors. Then, choose line or frame types of scan. In the Acquisition window, select FLIM mode to perform imaging combined with photon counting.Then, choose the white light laser pulse repetition rate. Start the preview imaging using Fast Live mode and adjust the fine focus of the imaging object on a section of interest. By looking at the pixel intensity histogram, adjust the appropriate laser intensity pinhole size and resolution.While in Fast Live, set the coordinates and scan direction and attribute them to begin and end in the Z-Stack window. Choose a z-step size or number of steps. Once all necessary settings are applied, start imaging.Give the image an appropriate name and save the imaging project. Different formation methods resulted in varying spheroid sizes. HCT116 spheroids in low attachment plates were significantly larger after five days compared to high throughput methods.Low attachment methods led to the evident development of a necrotic core detected by the propidium iodide staining. In contrast, spheroids generated with other methods demonstrated the diffused distribution of dead cells across the spheroid body. Oxygenation in HCT116 spheroids produced by different methods showed more oxygenated spheroid with the microtissue and lab-made micromolds than the Sphericalplate 5D.Spheroid oxygenation of Sphericalplate 5D spheroids showed lower oxygenation compared to microtissue and lab-made micromolds. Phasor analysis of HCT116 spheroids made using low-attachment plates reveals the presence of glycolytic and non-glycolytic cores via two-photon NADPH-FLIM.