우리는 (S2D) 프로젝트 &#39;질병에 시냅스&#39;우리 자금에 대한 혁신에 대한 캐나다 재단의 자금 출처 게놈 캐나다와 게놈 퀘벡, 그리고 Université 드 몬트리올뿐만 아니라 자금을 감사드립니다.

1. 드 노보 변이로 인해 발생할 수 있습니다 질병의 선택 다음 기준에 해당하는 질병은 드 노보 변이의 가설을 저장할 수 : <ol><li> 생식 적합성이 줄어 듭니다. </li><li> 질병의 빈도는 널리 환경 변화에도 불구하고 상대적으로 높은 지속됩니다. </li><li> 질병은 높은 아버지의 나이가 연결되어 있습니다. </li><li> 클래식 연계 및 협회 연구는 질병 heritability의 상당 부분을 설명하지 못했습니다. </li><li> 트윈 일치 데이터는 드 노보 모델을 지원합니다. </li></ol> 드 노보 변이가 일부에서 유전 기초를 설명 수있는 일반적인 질병은 중요한 첫 단계입니다 가능성 분석. 2. 케이스 및 DNA 샘플의 선택 적절한 샘플의 선택은 드 노보 변이의 식별의 성공을 위해 중요합니다. 드 노보 변이를 찾는 기회를 극대화하기 위해, 우리는 다음을 추천 : <ol><li> 영향을받지 부모, 나이가 아버지와 질병의 확대없이 가족 역사를 가진, 발병, 심한 표현형의 어린 나이와 사례를 선택합니다. </li><li> 그의 사용할 수 DN​​As 연구를 실시 충분 환자를 선택합니다. 특히 중요한 culturing의 대상이 아니었 일차 전지 소스 (예 : 혈액 DNA 또는 타액 DNA)에서 DNA의 가용성은, </li><li> 양쪽 부모 DNA의 가용성 변이 전송 상태 (대 드 노보를 상속) 결정하기 위해 중요합니다. 후보 유전자가 확인되면 추가 영향을 동료 및 일반 컨트롤의 가용성 유전자 확인 연구가 필요합니다. </li><li> 변이 속도, 상영하는 유전자의 양과 드 노보 돌연변이에서 발생할 수 가지 경우 분율의 추정에 따라 표본 크기를 예상하고있다. </li></ol> 3. 진 resequencing, 두 가지 주요 방법 <ol><li> 고품질 낮은 처리량 시퀀싱 이 접근법은 후보 유전자 접근 방식을 기반으로합니다. <ol><li> 후보 유전자의 선택 (S) 6 주요 기준에 건설되는 점수 시스템을 바탕으로 최고의 후보 유전자를 선택합니다. 다음 표 1에 나열된 여섯 기준을 사용하여 귀속 모든 포인트의 합계 통신을 총 계산합니다. 선택과 선택되지 않은 유전자 분포의 그림 1에서 우리의 프로젝트에서 예제를 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="표 1"/> 후보 유전자 선택에 사용되는 표 1. 기준 <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 우리 프로젝트의 시퀀싱에 대해 선택하고 선택하지 않은 유전자의 분포를 보여주는 그래프. 우리는 그들의 점수 값에 따라 정렬 유전자에 의해 후보 등록에 의해 순위가 유전자의 분포를 획득하였습니다. 예를 들어, SHANK3과 NRXN1 유전자, 우리는 드 노보 변이를 발견이 유전자 (최대 12) 각각 점수 7 6 있었다. </li><li> Exonprimer 통해 Primers3 소프트웨어를 사용하여 디자인 primers. 전용 영역을 코딩 및 스플 라이스 교차점은 엑슨의 각 측면에 여분의 50 기본 쌍을 포함하여 적용해야합니다. </li><li> DNA 형성 촉매의 선택에 대한 최적화 PCR 조건, 반응 볼륨 등 </li><li> 모든 PCR 조각을 최적화 </li><li> 표준 절차에 따라 혈액 샘플에서 추출한 게놈 DNA의 5 NG를 증폭 </li><li> 시퀀싱을 위해 보내기 전에 2 % 아가로 오스 겔을 로딩하여 PCR 제품의 품질 관리를 않습니다. 무작위로 샘플을 선택했습니다. </li><li> 한 가닥의 DNA 분석에 순서 PCR 제품. 흔적의 90 % 이상의 분석이 가능하면 조각이 성공적으로 합성 간주됩니다. 이것은 대규모의 심사에 대해 적용됩니다. </li><li> 변형 감지 <ol><li> 이러한 PolyPhred, Polyscan 및 돌연변이의 서베로 게놈 유사 감지 및 genotyping 도구를 사용하십시오. 2 개 이상의 검색 도구의 조합이 이상적입니다. 예를 들어, V.5을 PolyPhred하고 기본 설정이 같은 변화를 감지하지와 V.6를 PolyPhred. v.3 Polyscan는 INDELs (93 %)에 대한 SNPs (96 %)과 적은 비용으로 높은 거짓 긍정적인 돌연변이 속도를했습니다. PolyPhred V.6 사실 INDELs의 대부분을 감지하지만 (90 %) Polyscan v.3 전체보다 낮은 거짓 긍정적인 돌연변이 속도를 (INDELs)을하지 않았다. 우리는 v.3 Polyscan에 대한 SNPs 감지 옵션을 제거하고 V.5 PolyPhred 모두 유지하고 변형 감지 V.6를 PolyPhred해야합니다. 돌연변이의 서베 및 Polyscan는 indels 검출에 더 있습니다. 참고 : Polyscan를 사용할 때 SNP 검출의 옵션이 적용되지 않습니다. 오직 &quot;indel&quot;옵션을해야합니다. Polyscan는 SNP 탐지 많은 거짓 긍정으로 생성되었습니다. </li><li> 각각의 독특한 소설 exonic 변종이 발견은 조각과 resequ을 reamplifying하여 수동으로 확인기술적 유물을 제거하기 위해 역방향 앞으로 primers를 사용하여 proband와 부모 모두를 encing. </li></ol></li></ol></li><li> 전체 exome 시퀀싱 이러한 접근 방식은 인간 genomes의 영역을 코딩의 대부분을 타겟으로 높은 처리량 시퀀싱입니다. 우리는 지금 현재 잠재 후보 유전자의 검출을 가속, 우리가 실험실에서이 새로운 접근 방식을 사용하고 있습니다. <ol><li> 로체와 같은 다른 애질런트 또는 기타 유사한 제품의 설계 16,000 이상 유전자의 코딩 영역 (게놈의 50 MB)를 대상으로 &quot;SureSelect 인간 모두 엑슨&quot;을 주문. 캡처 키트를 주문하기 전에, 시퀀싱 플랫폼 (Illumina VS 고체) 결정되어야합니다. </li><li> 애질런트 프로토콜에 따라 캡처를 수행 </li><li> 여러분의 각각의 가능한 차세대 플랫폼에서 시퀀스 제품 </li><li> 전체 exome 배열의 변형 검출 : 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 게놈 유사 감지 및 genotyping에 대한 몇 가지 생물 정보학 도구 등 BWA, Bfast, 정렬을 수행합니다 Bioscope로 사용할 수 있습니다. 그 이후 추가로 자유롭게 사용할 하류 도구 (예 : SAM 도구, Varscan, Annovar)는 변종을 호출하고 주석하는 데 필요한 것입니다. 순서 정렬 및 변형 전화 및 주석을 포함 상용 소프트웨어는 또한 NextGEN (Softgenetics), CLC 바이오, 그리고 다른 사람으로 사용할 수 있습니다 </li></ol></li></ol> 4. 게놈 변형 우선 순위 확인된 변종은 다음 드 노보 및 단백질 또는 mRNA 기능 및 / 또는 구조에 해로운되는 그들의 확률에 따라 후속 조치의 우선 순위입니다. 변종은 다음과 같이되어야 드 노보 변종의 검출에 대한 우선순위를 따르십시오 : <ol><li> 고유 변형​​ (하나의 경우 한 번 휴일) </li><li> 유사는 부모에 존재하지 </li><li> 단백질 truncating 변화 : 말도 안돼, frameshift 및 splicing 변이로 이어지는 indels합니다. </li><li> Missense과 자동 변형 (예를 들어, mRNA의 splicing에 영향을) 기능 파괴로 예측했다. 단백질의 기능 예측 효과 Polyphen, 선별 및 표범을 사용합니다. </li></ol> 전체 exome 배열을 사용하는 경우 후보 유전자의 선택은 진학에 대한 우선순위를 변형에 대한 전략으로 사용할 수 있습니다. 5. 유전자 검증 <ol><li> 추가 환자 케이스 (다른 원인이되는 변이를 식별) 및 컨트롤의 전체 유전자를 Resequence. 컨트롤 샘플 우선순위 변종 allelic 주파수를 평가하는 데 사용됩니다. 다른 환자 (하지만 컨트롤 샘플 또는 공공 데이터베이스에)에있는 적어도 두 개의 서로 다른 데 노보 해로운 돌연변이 (넌센스, splicing, frameshifts 및 손상 missense 예상)이 들어있는 유전자는 매우 더 검증 연구 우선되어야합니다. 환자에서 파생된 lymphoblastoid 세포 라인에 잠재적인 splicing 결함 1) 테스트 :이 포함​​되어 있습니다. 우리의 경험에서, 대부분의 유전자 lymphoblastoid 세포 라인에서 RT - PCR 제품 수율, 2) 추가 시험의 기능 수준에서 돌연변이 / 유전자) lymphoblastoid 세포 라인과 3 단백질 추출물의 양적 서양 얼룩 분석에 의해 변경 단백질 발현 수준을 조사 동물 (C 엘레간스, Zebrafish)과 이전의 그룹 (예 : 5,6)에 의해 수행과 같은 세포 라인 모델. </li></ol> 6. 대표 결과 : 이 프로토콜에 따라, 우리는 정신 분열증과 자폐증에 대한 새로운 유전자를 식별할 수 있었다. 한 예로 우리가 최근 SHANK3 유전자 발견 (그림 2)입니다. SHANK3 유전자에 두 개의 서로 다른 드 노보 변이 한 영향을 여성의 세 형제 영향을 하나의 missense 변이에서 발견된 난센스 돌연변이. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 가족 PED 419 세 영향을받는 형제의 R1117X의 난센스 돌연변이의 (A) 독방. proband은 화살표로 표시됩니다. PED 56 (B) proband에서 R536W의 missense 변이의 독방 아니지만 그 이외의 영향을받는 형제.

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	<li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia.">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li><li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia:+manifestations,+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study.">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , 1-97 (1992).</li><li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+risk+and+paternal+age:+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes.">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li><li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder.">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li><li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia.">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism.">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li><li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes.">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 설명된 절차는 가능성이 결과, 부분, 드 노보 돌연변이에서,이 가설을 증명하기 위해 특정 흔한 질병을 파악하는 것을 목표로하고있다. 드 노보 변이 예를 유전 암 syndromes에 대한 질병의 숫자의 개발을위한 잘 구축 메커니즘 있지만, 제대로 흔한 질병으로 살펴왔다. 이것은이 DNA의 대량의 시퀀싱을 필요로 드 노보 변이의 식별에 관련된 기술적인 도전의 부분 결과에 최근 차세대 시퀀싱의 출현과 함께 비용 효과됩니다. 또한, 인간의 드 노보 변이 율은 매우 최근까지, 오직 예상했다. 단지 아주 최근에이 보고서를 직접 인간의 변이 속도를 결정했습니다. 이전 다음 측정하기 위해서는 이런 종류의 연구에 필요한 표본의 크기를 예측하고 관찰 드 노보 돌연변이 속도는 기본 속도보다 큰 경우에는 결정하기 힘들었다. 전체 게놈 대 후보 유전자를 시퀀싱? 보고된 질병 돌연변이의 대부분 missense / 넌센스 돌연변이 있으며, 우리의 심사 전략 알려진 돌연변이 중 68 % 이상 식별하는 것입니다 스플 라이스 사이트 돌연변이 (HGMD 웹 사이트에 따라)이되기 때문입니다. 아미노산 교체의 심각와 임상 표현형의 가능성 사이에 명확한 관계가 있습니다. 마찬가지로 보수적인 아미노산 치환에 비해 말도 변경보다 9.0 배 임상 7 제시 가능성이 높습니다. 따라서 이번에 시퀀싱 후보 유전자가 가장 비용 효과적인 전략이다. 설명 프로 시저의 성공은 세부 사항에서 설명한 두 예제, 자폐증과 정신 분열증을 사용하여 그림 몇 가지 중요한 단계에 따라 달라집니다. 이러한 선택하는 질병으로 피해야 할 많은 함정이있다 어떤 화면, DNA의 소스 효율적 드 노보 변이를 식별하는 방법에 대한 자세한 내용을 환자. 우리는 가장 효율적으로 이러한 자발적인 돌연변이의 결과 질병의 경우의 분율을 결정하는 방법을 제공합니다.

a strategy to identify de novo mutations in common disorders such as autism and schizophrenia

같은 자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애에 대한 메커니즘로 드 노보 변이의 역할을 지원하는 증거가 여러 라인이있다. 첫째, 인간의 드 노보 변이 속도가 상대적으로 높은 새로운 돌연변이 인구의 높은 주파수에서 생성됩니다. 그러나, 드 노보 변이가 가장 흔한 질병에보고되지 않았습니다. 배아 단계 또는 감소 생식 적합성 이러한 파괴 장면을 보여 주죠로 표현형,에 대한 강한 부정적인 선택이 심각한 질병에 최고의 유전자에 돌연변이가 여러 가족에게 전염되지 않습니다, 따라서 결합 유전자 매핑 또는 협회에 의해 감지되지 않습니다 연구. monozygotic 쌍둥이에서 매우 높은 일치의 관찰과 dizygotic 쌍둥이 매우 낮은 일치도 강하게 가지 경우 상당한 분율이 새로운 돌연변이에서 발생할 수있는 가설을 지원합니다. 이러한은 자폐증과 정신 분열증과 같은 질환의 경우입니다. 둘째, 감소 생식 피트니스 1과 매우 가변 환경 요인에도 불구하고, 일부 질병의 발병률이 상대적으로 높고 일정한 속도로 세계적으로 유지됩니다. 이것은 전세계적으로 약 1 %의 발병률과 자폐증과 정신 분열증의 경우입니다. Mutational 부하가에 대한 선택 사이의 균형 또는 드 노보 돌연변이에 의해 해로운 돌연변이 및 생산에 대한 생각을하실 수 있습니다. 생식의 낮은 가격은 궁극적으로 감소 질병 유행 선도, 인구의 돌연변이 대립 유전자의 개수를 줄일 수 있어야 부정적인 선택 요소를 구성합니다. 이러한 선택적 압력은 다른 환경에서 서로 다른 강도의 경향이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 심각한 정신 질환은 그들이에 대한 강한 부정적인 선택에도 불구하고 문화와 국가의 광범 세계 인구의 지속적인 비교적 높은 유행에서 유지되었습니다. 이것은 높은 새로운 돌연변이 비율이 있었다고하지 않는 한, 감소 생식 적합성과 질병의 예측 될지되지 않습니다. 마지막으로, 아버지의 나이의 영향 :이은 아버지 드 노보 변이에서 연령 관련 증가에서 발생할 수 증가 아버지의 나이와 질병의 증가 위험이 상당히 있습니다. 이것은 자폐증과 정신 분열증 세의 경우입니다. 돌연변이 속도의 남성 대 여성 비율은 아마도 남성의 나이가 세균 세포 분열의 높은 숫자로 인해 약 4-6:1 규모이다. 따라서, 하나는 드 노보 변이가 더 자주 남성, 특히 기존의 남성 4에서 온 것이라고 예측합니다. 유전자 연구가 지금까지와 같은 자폐증과 정신 분열증과 같은 단지 질환의 유전자에 predisposing 많은 유전자를 식별하는 데 실패, 왜 질병이 인간 게놈에서 유전자의 단순한 3%에 대한 확인되었습니다 이유는 새로운 변이의 높은 비율은 부분적으로 설명 있습니다 . 질병의 원인으로 드 노보 변이에 대한 식별 공부 부모와 영향을받는 과목을 포함하는 타겟 분자 접근을 필요로합니다. 질병의 유전 기초가 드 노보 변이에서 부분이 연결이 예에서 볼 수 있듯이 자폐증과 정신 분열증을 사용하여 그림 것입니다 확립 분자 접근을 초래할 수있다면 결정하기위한 과정입니다.

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애를 일으키는 데 노보 변이를 찾기위한 분자 유전 전략.

같은 자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애에 드 노보 변이를 식별하는 전략

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

25.6K 조회수.  Universite de Montreal. 자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애를 일으키는 데 노보 변이를 찾기위한 분자 유전 전략.

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Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

초점 대뇌 국소 빈혈에 조기 허혈성 공차를 유도하기 위해 적절한 전처리 자극으로 양측 경동맥 동맥 폐색

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

연구

의학

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

<em&gt; OVO에서</em육종을위한 Xenograftmodel으로&gt; CAM-분석

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

하부 요로 약리학을 평가하는 방법으로 방광 평활근 스트립 수축성

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

편리한 도구로 안저 사진은 역학 연구에서 심혈관 질환의 위험 요인에 대한 미세 혈관 응답을 연구하기 위해

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

내분비 및 외분비 리 프로그래밍과 대량 살상 무기 확산 모델로 췌관의 결찰을 통해 마우스 췌장 외과 부상

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

Vivo에서 토끼 일반적인 경 동맥 내 피에 유전자 이동

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

토끼에서 다이어트 유발 된 변화 증후군의 실험 모델: 방법론 고려 사항, 개발 및 평가

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

일반적인 경 동맥 중재 이식 정 맥 경에서에서 튼튼한 Transgene 식의 토끼 모델

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...