1. 샘플 고정 및 수지 삽입 <ol><li> 신선한 조직과 세포의 샘플은 2 % paraformaldehyde에 적어도 2 시간 동안 고정하고, 7.4의 산도에 0.1 M 인산 완충액에서 2.5 %의 글루 타 알데히드입니다. 샘플 크기가 충분히 침투 또는 정착액을 허용 두께 0.150 mm를 넘지 않아야합니다, 12 시간 이상에 대한 수정에 남아있을 수 없습니다. </li><li> 20ml 유리 섬광 튜브 안에 샘플을 놓고 그들에게 0.1M cacodylate 버퍼에 세 번 5 분 각각, 린스. </li><li> 1.5 % (W / V) 30 분 0.1 M cacodylate 버퍼 (0.1 M, pH를 7.4)에 칼륨 ferrocyanide 1 % (W / V) 오스뮴의 tetroxide로 얼룩. </li><li> 30 분 0.1M cacodylate 버퍼에서 1.0 % (W / V) 오스뮴의 tetroxide로 얼룩. </li><li> 3 분 두 번 증류수로 한번 헹구어. </li><li> 1퍼센트 (W / V) 30 분 더블 증류수에 uranyl 아세테이트와 청바지. </li><li> 등급 알코올 시리즈 2 분 각 변경 (1 X 50 %, 1 X 70 %, 1 X 90 %, 1 X 95%, 2 X 100 %)에서 탈수 후 두 번 증류수로 5 분 섹션을 씻어합니다. </li><li> 70 %, 90 %, 95% 후 100 % : 에탄올의 50 % Durcupan에서 시작 에탄올과 혼합 Durcupan 수지, 각각의 변화 30 분, 증가 농도에 임베드 다음 다음. </li><li> 신선한 Durcupan로 교체하고 4 시간 동안 천천히 선동. </li><li> 플레이스 섹션, 금형 분리 요원과 함께 코팅하고, 65 곳에 유리 현미경에 나무 칵테일 스틱을 사용하여 슬라이드 24 시간 동안 ° C 오븐. </li></ol> 2. 동기 / SEM에 대한 샘플을 준비 <ol start="11"><li> 두 유리 현미경 슬라이드 사이에서 샘플을 포함, 수지 층을 분리하고 에이전트를 분리하는 곰팡이를 제거하는 완전히 씻으십시오. </li><li> 낮은 전력 목표와 전송 가벼운 현미경을 사용하거나, 수지의 단면 내에서 관심 영역을 식별하는, 전송 조명과 현미경을 해부. </li><li> 면도날을 사용하여 관심 지역의 주위에 사각형 소형 (3mm X 3mm)을 잘라 아크릴 접착제로 빈 수지 블록 (그림 1)의 상단에 넣어 둬요. 다음 단계로 진행 후 강화하는 접착제에 대한 5 분 기다려합니다. </li><li> ulramicrotome의 소유자로 블록을 고정하고, 첨부된 stereomicroscope를 사용하여 재료 남아의 단지 작은 피라미드까지 면도날과 관심의 주변 지역 장식. </li><li> 또한 관심의 영역이 정확하게와 관련하여 블록의 표면 (그림 1)의 크기를 찾을 수 있도록 ultramicrotome에 고정 유리 칼을 사용하여 블록을 잘라. 블록 중 하나 가장자리를 잘라 수직 단계는 (그림 1 및 2) 샘플을 통해 절단 있도록 관심있는 지역에 인접해 있습니다. 이 단계는 이미징 얼굴 (그림 2)을 형성한다. </li><li> 전송 가벼운 현미경을 사용하여 ultramicrotome 및 사진 블록 내에서 관심있는 지역에서 블록을 제거합니다. </li><li> 나머지 수지 스텁 멀리 손질 블록을 잘라 버릴거야. 이것은 보석의보고를 사용하여 수행되며 작은 블록이 동기 / SEM 안에는 것을 보장합니다. 이 블록의 총 높이가 5mm 이상해서는 안됩니다. </li><li> 몇 군데되는 측면이 바깥쪽 가장자리 (그림 1)에 있도록 탄소 붙여넣기와 알루미늄 스텁에 접착제가 블록. </li><li> 접착제가 마른 후, 황금의 얇은 층 (&gt; 20 NM, 크레싱턴 진공 증발 시스템)과 함께 코트 블록을. </li></ol> 3. 동기 / SEM의 영상 <ol start="20"><li> 낮은 배율에서, 그리고 관심과 블록의 측면의 선택 영역이 몇 군데 수 있도록 보조 전자 이미징 (5 KV, 0.5 nAmp), 동양 블록을 사용하여 (그림 2 C, D) 연산자에 직면하고 있습니다. </li><li> 동양 얼굴이 몇 군데 수 있도록 블록 밀링 빔에 평행하게 놓여 있습니다. 이것은 전자빔이 얼굴에 54 ° (그림 2 B)에서 지향을 의미합니다. </li><li> 13 현재 이온 빔 사용 - 30 KV에서 27 nAmps 것은 몇 군데로 지역의 정면에서 수지의 좁은 밴드를 제거합니다. </li><li> 관심 지역을 overlies 가공된 얼굴을 볼 수 backscattered 이미징 모드로 전환합니다. </li><li> (그림 2) 가공된하고 몇 군데로 구역에서 정확한 지역을 찾아 빛을 현미경 참고 이미지 (단계 16 촬영)와 가공된 얼굴의 이미지를 사용합니다. </li><li> 관심 지역 (그림 2) 위의 블록의 표면에, 현미경의 가스 주입 시스템을 사용하여 탄소 (또는 금속)의 보호 계층 (약 1 미크론 두께)를 입금. </li><li> 700 picoAmps, 잘게 밀 최종 이미지가 촬영되는 시간 블록의 영역의 전류를 사용합니다. </li><li> 완전히 밀이 이미지의 얼굴을 더 밀링 유물이 얼굴에 볼 수 없습니다까지로 밀링 광선을 둡니다. 얼굴의 전체 공장은보기의 전체 분야에 걸쳐 각 후속 이미지의 변화를 관찰하여 검사합니다. 부적 절한 밀링도 vertica을 나타나는 흰색 줄무늬 또는 &#39;커튼&#39;로 볼 수 있습니다베드로 이미지 인치 </li><li> 분산 어떤 온도 변화에 대한 최소 2 시간 현미경을 둡니다. 이것은 블록 얼​​굴 고르지 이미지 결과 이​​미징 동안 드리프트 것이라는 위험을 줄여줍니다. </li><li> 얼굴을 순차적으로 영상에 대한 현미경 매개 변수를 선택합니다. 전자빔은 블록 얼​​굴 소재의 매우 얕은 깊이에만 이미지를 충분히 낮은 전압을 가지고 있는지 확인합니다. 이것은 제거할 수있는 얼굴의 두께보다 훨씬 얕은해야합니다. 이미지에 대한 일반적인 매개 변수는 1.2 사이의 전압 있습니다 - 사이의 픽셀 크기 2.0 KV 4-20 NM. 픽셀 밀 얼굴을하고 하나의 이미지를 얻기위한 총 시간 (그림 3) 이분 아래에 유지되도록 10 μsecs 주위 보관 시간 요구를 머물러. </li></ol> 4. 성공의 비밀 단계 1) 샘플을 150 마이크론 이상의 두께되지 않습니다 확인하십시오. 이것은 물질에 다른 얼룩과 수지의 적절한 삽입을 가능하게합니다. 이것은 바로 고정 후 vibratome와 함께 샘플을 sectioning하여 얻을 수 있습니다. 이 두께는 뇌 조직에 적합합니다. 다른 조직은 적절한 고정과 얼룩을 보장하기 위해 테스트해야합니다. 단계 3) 샘플은 자유롭게 솔루션 전반에 걸쳐 분산,이 보조 정착액가 소개되는 동안 유리병의 한 부분에 함께 clumped 안해야합니다. 이것은 샘플의 최대 침투를 보장하고이 고정 과정에서 왜곡되는 샘플을 줄일 수 있습니다. 이것은 부드럽게 솔루션에 추가됩니다 즉시 유리병 내에 샘플을 소용돌이 치는 의해 이루어진다. 단계 15) 관심의 영역이 (&lt;30 미크론) 이하 바로 블록의 표면에 위치하고 있는지 확인하십시오. 이것은 이미지 수집 단계 중 이온 빔에 의해 밀링의 양을 줄일 수 있습니다. 단계 22) 이온 빔의 스캔 시간은 전체 영상 얼굴이 완전히 가공된 것을 보장하기 위해 adequte해야합니다. 부적 절한 밀링은 이미징 얼굴 아래로 수직으로 나타나는 흰색 줄무늬, 또는 &#39;커튼&#39;으로 표시됩니다. 단계 26) 최종 가공된 얼굴이 몇 군데있는 얼굴보다 큰해야합니다. 가공된 수지가 바로 근처에있는 블록 표면에 블록과 redeposits에서 나옵니다 때문입니다. 이 redeposition은보기의 이미지 필드에 잠식 수 있고, 몇 군데보다 훨씬 넓은 지역을 밀링에 의해 피할 수있다. 20 미크론 폭 이미지 창은 가공된 블록 얼굴은 30 마이크론 넓이보다 큽니다. 단계 29) 전자빔 매개 변수는 이미지 블록의 표면의 단지 처음 몇 나노미터에서 나오는 전자에 의해 생성되는 그러한 것을 중요 좋습니다. 이 2 KV 아래에 전압을 최소화되며 전자는 너무 멀리 침투하지 않는함으로써 acheved. 이것은 또한 높은 에너지와 단지 전자 최종 이미지에 기여하는 것을 너무 탐지기에 그리드 전압을 사용하여 도왔다는. 일반적으로, 1.3 KV의 그리드 장력은 1.5 KV의 영상 전압에 사용됩니다. 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 수지 블록의 준비.) 수지 steromicroscope에서 볼 성인 쥐 두뇌를 통해 코로나 섹션 (80 미크론 두꺼운)을 내장. 이미지가 명확하게 메스 블레이드를 사용하여 섹션 (B)에서 컷 수있는 서로 다른 뇌 영역을 보여줍니다. 여기 피질에서 1mm 광장이 제거되고 (C). D) 수지 블록이 다음 ultramicrotome에 탑재 유리 나이프로 손질하고, 일단 블록이 유일한을 떠날 감소되었습니다 빈 수지 블록에 붙어있다 관심 지역은 (E) 단계 F)가. 포함된 소재의 전면 표면에 수직 절단이 전체 손질 지역은 다음 수지의 나머지 부분에서 절단되며에서 알루미늄 금속 코팅 준비 스텁 및 이미징에 탑재 전자 현미경을 검사합니다. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2.가.) 동기 / SEM 영상을위한 블록의 얼굴을 준비하고 B) 블록과 이미징 얼굴 (검은 머리 이중 화살표로 표시) 만들기 가공된있는 가장자리에 그림을 표시합니다. 이온 빔 (흰색)의 위치는 이미징 얼굴에 평행하게 표시됩니다, 그리고 전자빔 (회색)가 이온 빔 54 °에서 얼굴을 때리는가 표시됩니다. C)이 전자빔로 촬영한 블록의 전경을 보여줍니다 그리고 이차 전자와 함께 몇 군데. 블록의 측면을 따라 어두운 지역 (점선 흰색 상자로 표시) 약 가공된되었습니다 얼굴의 일부를 보여줍니다 (이중 머리로 표시에드 검은색 화살표)는 기본 샘플을 공개합니다. D)이 지역에만 backscattered 전자를 사용하여 몇 군데 때 내장 조직 볼 수 있습니다. 여기는 임베디드 조직 섹션의 전체 너비는 이중 달린 흰색 화살표로 표시됩니다. C 규모 표시줄) 100 미크론이다. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 등방성 voxels과 뇌 조직의 이미징은 볼륨.) 쥐 두뇌의 영역 내에서 ultrastructure를 보여주는 블록의 얼굴 대조 backscattered 이미지를 레버 스드. 모든 점막이 표시뿐만 아니라 대형 macromolecular 구조입니다. B) 1600 이미지 전체가 등방성 voxels. C)이 스택이 동일한 해상도를 가진 비행기로 몇 군데 수있는 이미지 스택의 결과 5 nm의 간격에서 수집되었다. 이 이미지는 XY 평면과 yz 평면에 몇 군데있다 단일 시냅스 연결을 보여줍니다.

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

관심의 영역이 너무 크게하지 않을 때 동기 / SEM의 기술은 최적의 작동합니다. 몇 군데 볼륨에 대한 상한은 이온 빔 및 지역에 따라 그런거야 많은 시간 동안 반복적으로 일관 밀 수 있습니다. 지금까지이 60 주변 X 60 미크론의 영역 완료되었습니다 그러나, 영상이 전체 면적은 적합한 이미지 해상도와 같은 큰 이미지를 수집 시간 요소를 주로 인해 불가능합니다. 예를 들어, 픽셀과 4 kx 4 K 이미지 10 마이크로초 시간 2 분 취득 40 초가 걸릴 것입니다, 60 미크론의보기의 필드에이 단 15 NM의 픽셀 크기를 줄 것입니다 머물러. 이미징 세포와 조직의 ultrastructure 들어, 작은 픽셀 크기가 더 적합하다, 일반적으로 4 십 nm의 / 픽셀 사이. 현미경이 기능을했다하더라도 60 X 60 미크론의 영역에 대한 이미지가 10 시간 내에 취득 것입니다. 이러한 이유로, 현미경은 10 × 10 × 10 미크론, 또는 전체 세포의 중요한 영역의 순서로 이미지 볼륨에 이상적인 도구입니다. 이것은 쉽게이 절차와 잘 대비 아르 샘플에서 48 시간 기간 내에 할 수 있습니다. 지금까지 프로토콜은 뇌 조직뿐만 아니라 coverslips을 준수하는 교양 포유 동물 세포의 다양한 유형을 중심으로 사용되고 있습니다. 그러나, 고정 및 얼룩 절차는 동일하게 잘 대비 이미지 스택을 생산하는 식물을 포함한 생물 학적 물질의 많은 다른 유형과 함께 사용할 수 있습니다. 따라서이 기술의 주요 장점은 등방성 voxels와 이미지 볼륨의 용량입니다. 이런 종류의 이미지 스택은 스택에 비행기에서 촬영한 이미지를 사용하여 3D 볼륨의 분석을 위해 수 있습니다. 이 혜택은 모든 방향에서 이미지 시리즈와 큰 이미지를 세부 (그림 3)을 제공하는 이미지 기능 감시자를 허용하는 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> Cyanoacrylate 접착제 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 해부 현미경 : Leica MZ8 </td><td> Leica 이크로 시스템즈, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan 수지 </td><td> 시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, 스위스 </td><td></td></tr><tr><td> 동기 / SEM 현미경 (자이스 혈구, NVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유리 조직학 슬라이드 </td><td> 멘젤 - 글레이저, 독일 </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> 유리 나이프 메이커 : Leica EM KMR2 </td><td> Leica 이크로 시스템즈, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 섬광 튜브 (20ml) </td><td> EMS, 미국 </td><td> 72,634 </td></tr><tr><td> 글루 타 알데히드 </td><td> EMS, 미국 </td><td> 16,222 </td></tr><tr><td> 쥬얼리의 본 </td><td> EMS, 미국 </td><td> 72,010 </td></tr><tr><td> 몰드 분리 에이전트 </td><td> Glorex, 스위스 </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> 오스뮴의 tetroxide </td><td> EMS, 미국 </td><td> 19,110 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMS, 미국 </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> 인산염 버퍼에 대한 인산 염 </td><td> 시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, 스위스 </td><td> 71642 및 71496 </td></tr><tr><td> 나트륨 cacodylate </td><td> 시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, 스위스 </td><td> 20,840 </td></tr><tr><td> 골드 목표로 Coater의 스퍼터 </td><td> 크레싱턴, 미국 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 (TBS) </td><td> 시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, 스위스 </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotome : Leica UCT </td><td> Leica 이크로 시스템즈, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> Uranyl 아세테이트 </td><td> EMS, 미국 </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

이 프로토콜은 방법을 생물 학적 샘플, 뇌 조직처럼 초점을 맞춘 이온 빔 / 스캐닝 전자 현미경 (동기 / SEM)을 사용하여 3 차원에 몇 군데 수 있습니다 설명합니다. 샘플은 오스뮴의 tetroxide와 uranyl 아세트산을 사용하여 aldehydes, 중금속 묻은로 고정됩니다. 그들은 알코올로 다음 건조하고 다음 강화된있다 수지와 침입. 가벼운 현미경 유리 나이프와 ultramicrotome를 사용하여 표면에 가까운 영역이자를 포함하는 작은 블록이 이루어집니다. 블록은 다음 동기 / SEM 안에 배치하고, 이온 빔 가까운이 지역에, 블록의 한쪽을 따라 약 밀 수직 얼굴을하는 데 사용됩니다. 이미지 기본 구조를 backscattered 전자를 사용하여 작은 얼굴은 다음 미세한 이온 빔을 가공된하고 표면은 몇 군데와 가공된 수 얼굴의 정확한 지역을 파악하기 위해보다 긴밀하게 시시콜콜 따지는 것입니다. 현미경의 매개 변수는 다음 시리얼 이미지 블록의 볼륨을 통해 수집되도록 얼굴이 반복적으로 가공된하고 몇 군데되도록 설정되어 있습니다. 이미지 스택은 일반적으로 각 방향으로 작은 4 NM 같은 크기로 등방성 voxels이 포함됩니다. 모든 이미지 비행기에서 본 이미지 품질은 사용자가 이미지 스택 내의 모든 시야각에서 셀 ultrastructure을 분석 수 있습니다.

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

이 프로토콜은 수지 내장 뇌 조직은 전자 현미경을 스캐닝, 초점을 맞춘 이온 빔의 3 차원에 준비하고 몇 군데 수있는 방법에 대해 설명합니다.

초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.8K 조회수.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne. 이 프로토콜은 수지 내장 뇌 조직은 전자 현미경을 스캐닝, 초점을 맞춘 이온 빔의 3 차원에 준비하고 몇 군데 수있는 방법에 대해 설명합니다.

비디오: Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

연구

신경과학

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

원자 힘 현미경, 충격 들여 쓰기 및 유변학를 사용하여 뇌 조직의 멀티 스케일 기계 속성을 특성화

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

수지상 척추 연구를 위한 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...