연구 시설의 사용에 대해 Keimpe Wierda 박사와 조리스 드 위트 박사의 감독하에 VIB-KU 루벤 뇌 질환 연구 센터의 전기 생리학 단위에 감사드립니다. 또한, 우리는 이온 채널 연구의 실험실과 ENdometrium의 연구소의 모든 구성원에게 감사, 자궁 내막증과 그들의 유용한 토론과 의견에 대한 KU 루벤에서 생식 의학.
이 프로젝트는 연구 재단-플랑드르(G.084515N 및 G.0B1819N에서 J.V.)와 KU 루벤 연구위원회(C1-자금 C14/18/106~J.V.)로부터 자금을 지원받았습니다. K.P.는 FWO [PEGASUS]2 마리 Skłodowska-Curie 펠로우이며 연구 재단 플랑드르 (FWO)(12T0317N)와 마리 스크와도우스카 - 퀴리 보조금 계약 (665501)에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받았습니다. K.H.는 벨기에 플랑드르 연구 재단(12U7918N)의 박사 후 펠로우입니다.

이 연구를 위한 모든 동물 실험은 KU Leuven (벨기에)의 윤리적 검토 위원회에 의해 승인되었습니다 (P021/2012).
1. 고자장미 슬라이스 용액 및 인공 뇌척수액 (ACSF) 준비
<ol><li>실험일 이전<ol>
<li>실험실 등급 1형 물 함유(mM)을 함유한 10x 슬라이스 프리 솔루션 1L을 준비하십시오(mM): 25 KCl, 20 CaCl2,10 MgSO4,12.5 KH2PO4 (표 1). 칼슘 인산염 강수량을 방지하기 위해 800 mL H2O로 미리 채워진 비커에 화학 물질을 천천히 혼합하면서 자기 교반기로 지속적으로 저어줍니다. 용액을 4°C 또는 실온(RT)에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험의 날에<ol>
<li>실험실 등급 1형 물 함유(mM)를 함유한 1x ACSF 1L1L을 준비하십시오(mM): 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2,1 MgSO4,1.25 NaH2PO4,26 NaHCO3,25 포도당(표 2). 증기 압삼계를 사용하여 305-315 mOsm(pH ~ 7.55-7.6) 사이의 진동을 검증한다. 참고: 칼슘 인산염 강수량을 방지하기 위해 모든 고체 화학 물질을 H2O800mL로 미리 채워진 비커에 넣고 자성 교반기로 지속적으로 저어줍니다. MgSO를 추가 4 그리고 CaCl2 맨 끝에, 천천히 1 M 주식 솔루션에서 필요한 금액에 떨어지는.</li>
		<li>지속적으로 7.3-7.4 사이의 pH를 설정하는 카르보젠RT에서 1배 ACSF 솔루션을 버블. 참고: pH가 약간 너무 높거나 너무 낮으면 카보징 강도의 작은 조정이 충분할 것입니다. pH가 7.45보다 높은 경우, 1M NaH2PO4 용액의 몇 방울을 추가하여 조정한다.</li>
		<li>10x 슬라이스 프리 솔루션 25mL및(mM) 252mL를 함유한 비커에 1x 고자로즈 슬라이스 용액 250mL(뇌당)를 준비한다: 252 자크로, 26 NaHCO3,및 10 포도당(표3). 삼투석이 320-325 mOsm(pH ~ 7.55-7.6) 사이인지 확인합니다.</li>
		<li>7.3-7.4 사이의 pH를 제어하는 카보젠으로 10-15 분 동안 높은 자당 슬라이스 용액을 거품. 참고: pH가 7.45보다 높은 경우 1M KH2PO4 용액을 몇 방울 추가하여 조정합니다.</li>
		<li>고자당 슬라이스 용액을 울트라 냉동고(-80°C)에 20~30분 동안 저장하여 부분적으로 동결될 때까지 보관합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 뇌 해부를 위한 작업 공간 준비
<ol><li>높은 자당 슬라이스 용액의 냉각 중에 다음을 준비하십시오.<ol>
<li>수조를 32°C로 데우습니다.</li>
		<li>환원ACSF 용액으로 회수챔버(도2A)를채우고 챔버를 수조에 놓는다. 지속적으로 복구 챔버에 주요 ACSF 병 및 ACSF에 카르보겐을 적용합니다.</li>
		<li>동물을 실험실로 안내합니다. 참고: 동물의 나이, 성별 및 긴장은 개별 적인 실험자에 의해 결정되어야 하고 특정 연구 질문에 달려 있습니다. 그러나, 동물의 매개 변수는 다른 실험 일 간의 비교성을 보장하기 위해 하나의 연구 내에서 일정하게 유지되어야한다. 이 프로토콜은 2-6주의 나이에 C57BL/6J 남성 마우스의 사용을 위해 설계되었습니다. 오래된 동물이 사용될 경우, 슬라이스 및 복구 솔루션은 급성 슬라이스의 뇌 건강을 보존하기 위해4,27 (예를 들어, NMDG+기반 용액23,28)에따라 적응해야 할 수 있습니다.</li>
		<li>마취 챔버를 준비합니다.</li>
		<li>티슈 페이퍼, 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 넓은 개구부(컷 오픈), 얼음으로 채워진 90mm 배양 접시, 차가운 문화 접시 위에 필터 용지의 사각형, 참수, 해부 가위, 곡선 집게, 주걱, 35mm 배양 접시, 미세 브러시, 블레이드, 표본 플레이트 (진동과 함께 제공), 슈퍼 접착제, 파이펫 팁, 필터 종이 4 스트랩 (2cm x 0.5cm)(그림 2A)의상단에 필터 용지의 사각형.</li>
		<li>진동성 설정: 먼저, 올바른 설정(블레이드 이동 속도: 0.08mm/s, 절단 진폭: 1.4mm, 절단 주파수: 85Hz)에 대한 진동을 프로그래밍하고 슬라이스 챔버에 카르보겐 라인을 부착합니다. 다음으로, 슬라이스 챔버를 홀더에 놓고 슬라이스 챔버를 둘러싼 홀더를 얼음으로 채우고 모든 것을 진동에 부착합니다. 마지막으로, 진동기 블레이드홀더(그림 2B)에면도날을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>높은 자당 용액의 동결 후 다음 단계를 수행한다.<ol>
<li>20-30 분 후, -80 °C 울트라 냉동고에서 높은 자당 슬라이스 용액을 꺼내 얼음에 비커를 유지합니다.</li>
		<li>벤치에 있는 진동체 옆에 높은 자당 용액을 놓고, 부분적으로 얼어붙은 용액을 주걱으로 분쇄하고 섞어 좋은 슬러시를 얻고 카르보겐으로 거품을 냅니다.</li>
		<li>플라스틱 파스퇴르 파이펫으로 고자장미 슬라이스 솔루션을 사용하여 차가운 90mm 배양 접시 위에 제곱 필터 용지를 담그십시오.</li>
		<li>35mm 배양 접시(또는 전체 뇌를 보관하기에 적합한 동등한 작은 용기)를 고자장미 슬라이스 솔루션(뇌 전체를 덮기에 충분함)으로 최대 75%까지 채우고 나머지 용액과 함께 비커 옆에 보관된 얼음의 문화 접시를 식힙니다. 35mm 배양 접시에 용액을 카보게네이트.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 뮤린 뇌의 해부 및 위치
<ol><li>5% 이소플루란으로 동물을 마취시합니다. 발을 꼬집어 마취의 적절한 깊이를 결정합니다. 발 철수 반사가 발생하지 않아야합니다.</li>
	<li>티슈 페이퍼에 동물을 옮기고 강한 가위 나 작은 동물 기요틴으로 참수하십시오.</li>
	<li>해부 가위를 사용하여 두피를 잘라냅니다.</li>
	<li>처진 봉합사를 따라 calvaria를 열고 후각 전구를 포함한 전체 뇌가 보일 때까지 구부러진 집게의 도움으로 제거하십시오. 참고: 칼바리아 또는 집게의 날카로운 가장자리로 뇌를 손상시키지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>주걱을 사용하여 조심스럽게 뇌를 떠냅니다 (후각 전구는 부착 된 상태를 유지해야합니다).</li>
	<li>차가운 35mm 배양 접시에 뇌를 옮기고 ACSF가 채워진 파스퇴르 파이펫으로 뇌를 부드럽게 세척하여 조직으로부터 모든 머리카락 이나 혈액 입자를 제거합니다 (혈액은 뇌 조직에 세포 독성 효과가있습니다 29).</li>
	<li>차가운 90mm 배양 접시 위에 젖은 필터 용지에 주걱의 도움으로 뇌를 전달(그림 2A).</li>
	<li>블레이드를 사용하여 뇌를 반으로 자르고 두 반구를 분리하고 두 반구를 갓 잘라낸 내측쪽에 두 반구를 놓습니다.</li>
	<li>블레이드를 사용하여 등부(5%-10%)를 제거합니다. 등쪽 상단(그림 2C)30에 평행컷을가진 각 반구의 뇌는 두 반구를 갓 잘라내고 뇌의 복부 부분이 위쪽으로 향하고 있다.</li>
	<li>시편 플레이트에 슈퍼 접착제 한 방울을 놓고 파이펫 팁으로 제대로 펴서 두 반구를 모두 수용할 수 있습니다.</li>
	<li>필터 용지 스트랩을 사용하여 필터 용지 스트랩으로 복부 측면을 터치하여 모세관 힘으로 한 반구를 집어 들며 조직을 손상시키지 않습니다.</li>
	<li>다른 필터 용지 스트랩을 사용하여 시편 플레이트의 접착제 위에 등쪽 면으로 반구를 배치하기 전에 뇌의 등쪽을 조심스럽게 반건조시합니다. 두 번째 반구와 동일한 절차를 반복합니다. 참고: 반구는 진동판의 미러방식으로 수평 정렬에 배치되어야 하며, 로스트랄 면은 외부를 가리키고, 코물 면은 중간에 서로 마주보고(만지지 는 않음). 양반구의 내측은 진동블레이드와 측면면을 실험자쪽으로 가리킨다(도2D).</li>
	<li>시편 판을 슬라이스 챔버에 놓고 빠르지만 조심스럽게 얼음 차가운 고자장미 슬라이스 용액 슬러시로 덮습니다. 용액이 접착제에 닿자마자 반구를 시편 판에 단단히 고정하고 적절하게 붙입니다.</li>
	<li>반구가 고자장미 슬라이스 용액으로 적절하게 덮여 있는지 확인하고 용액이 카보겐으로 거품이 있는지 확인하십시오. 참고: 전체 해부 절차는 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 뇌가 매우 오랜 시간 동안 산소의 공급없이 유지되지 않도록하십시오. 그것은 높은 자당 슬라이스 솔루션 슬러시에서 뇌 침수에 참수에서 약 1-1.5 분 정도 걸릴 한다. 이것은 슬라이스의 높은 품질을 보증하기 위해 급성 뇌 슬라이스 준비에 대한 가장 중요한 요구 사항입니다.</li>
</ol>4. 뇌의 수평 슬라이스
<ol><li>반구의 내측 앞에 진동 블레이드를 배치하고 지금 위쪽으로 향하고있는 반구의 복부 측면과 동일한 높이로 낮춥다. 진동 제어의 도움으로 블레이드를 등쪽 방향으로 600 μm로 낮추고 슬라이스를 시작합니다. 블레이드는 조직에 충돌해야합니다 (그렇지 않은 경우, 블레이드를 반전하고 조금 더 하급). 처음 두 조각이 두 반구에서 완전히 분리될 때까지 슬라이스합니다.</li>
	<li>블레이드를 뒤집고 다른 300 μm을 낮추고 다시 슬라이스합니다.</li>
	<li>해마가 보이면 (필요한 경우 마우스31 뇌 아틀라스를 사용하여 도움을 요청)(그림 2E)확대 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로 조각을 수집합니다. 카우다테 푸타멘이 해마 옆에서 보일 때까지 조각을 수집합니다. 전형적으로, 300 μm(반구당 4-6)의 8-12슬라이스 사이마우스 뇌를 위해 수집될 수 있다.</li>
	<li>플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조각을 수집하고 수조(그림 2F)의복구 챔버로 전송합니다 (슬라이스 챔버에서 떠다니는 것을 방지하기 위해 슬라이스의 각 라운드 후 조각을 수집). 참고: 가능한 한 빨리 작업하고 높은 자당 슬라이스 솔루션이 전체 절차 중에 얼음처럼 차갑고 환전되도록 하십시오. 필요한 경우 슬라이스 챔버 를 둘러싼 얼음을 다시 채웁니다.</li>
</ol>5. 전기 생리학적 기록을 위한 뇌 슬라이스 회복
<ol><li>ACSF가 채워진 복구 챔버에 슬라이스를 32°C 수조에 1시간 동안 둡니다. 참고: 복구 챔버도 시판됩니다.</li>
	<li>수조에서 복구 챔버를 가져 가라.</li>
	<li>추가 응용 프로그램을 시작하기 전에 복구를 위해 적어도 30분 동안 조각을 RT에 놓습니다.</li>
</ol>6. 해마의 내측 천공 경로 (MPP)에서 fEPSP 녹음
<ol><li>가로 파이펫 풀러와 보로실리케이트 유리 모세혈관에서 녹음 파이펫을 당겨 ACSF 솔루션으로 채워지고 ACSF가 채워진 녹음 챔버에 침지될 때 ~ 2 MΩ 크기의 파이펫을 받습니다.</li>
	<li>레코딩 챔버에 연결된 중력 제어 다중 배럴 관류 시스템에서 적절한 화학 물질(예를 들어, Bicuculline)을 포함하는 ACSF 목욕 용액 및 ACSF 용액을 채우는 다중 배럴 관류 시스템을 채우는 다중 배럴 배스용. 모든 솔루션을 지속적으로 카보게네이트합니다.</li>
	<li>녹음 챔버의 관류 라인의 반대방향으로 끝나는 흡입 튜브에 연결된 연동 또는 진공 펌프를 켭니다. ACSF가 채워진 배럴을 열고 연속 흐름(초당 1-2 방울)을 설정합니다. 참조 전극이 ACSF 솔루션에 침수되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>설정 컴퓨터, 증폭기, 미세 조작기, 자극기, 현미경 광등, 카메라 및 모니터(해당하는 경우)를 켭니다.</li>
	<li>전기 생리학적 기록에 적합한 소프트웨어를 엽니다(전기 생리장비를 위한 여러 가지 하드웨어 및 소프트웨어 제공업체가 있음).</li>
	<li>1개의 뇌 슬라이스 반구를 회복챔버로부터 슬라이스 설정의 기록 챔버로 옮기고, 시야내의 기질류 과립 세포층 및 분자층을 사용하여 올바른 방향으로 배치한다. 자극 전극이 내측 피질의 방향에서 슬라이스의 MPP에 도달할 수 있는지 확인하고 기록 전극이 CA3의 방향에서 정반대측에서 MPP에 접근할 수 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>종이클립(그림 3A)또는 시판 가능한 뇌 슬라이스 그리드로 기록 챔버에서 슬라이스를 안정화시합니다. 참고: 슬라이스 전송 및 위치 지정 중에 관류를 끄는 것이 유용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 뇌 슬라이스의 품질을 보장하기 위해 너무 오래 걸리지 않아야합니다.</li>
	<li>과립 세포층(도3B)에가까운 분자층의 하부 3분의 1에서 MPP에 기록 및 자극 전극을 하강하고 배치하여 약 100-150 μm의 거리에서 서로 마주한다. 자극 전극은 표면에 최소한의 접촉해야 하며, 기록 전극은 상층층에 약간 침투해야 합니다.</li>
	<li>fEPSP 신호를 얻기 위해 뇌 슬라이스에 낮은 강도 자극(0.1 ms용 30-50 μA)을 적용합니다. 필요한 경우 전극의 위치를 조정합니다(예: 낮거나 비정형모양fEPSP 신호).</li>
	<li>입력 출력 곡선 녹음 시작: 30초 간격으로 뇌 슬라이스에 자극 강도 증가 적용.</li>
	<li>자극 강도를 최대 fEPSP 응답의 50%로 설정하고 뇌 슬라이스에 30초 간격으로 20~40분 동안 50% 자극 강도를 적용한 기준선 fEPSP 레코딩을 시작합니다.</li>
	<li>기준선이 안정된 것처럼 보이는 경우 추가 기록(예: LTP/LTD 프로토콜 및/또는 약물 응용 프로그램)을 진행합니다. (MPP의 LTP 유도의 경우, 여기서 5분 간격으로 적용된 4회 1s 100Hz 펄스로 구성된 프로토콜이 사용되었다. 비큐컬린은 컨디셔닝 단계 전과 10분 전에 적용하였다.) 참고: 모든 레코딩은 적절한 로우패스 필터링(&5kHz) 및 샘플링 속도(>10 kHz)를 통해 현재 클램프 모드에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>적절한 파일 형식으로 데이터를 추출하고 섬유 발리, fEPSP 진폭 및 fEPSP 경사와 같은 fEPSP 매개 변수를 분석합니다.</li>
</ol>7. 칼슘 이미징 뇌 슬라이스 기록
<ol><li>12웰 챔버에서 뇌 슬라이스 반구 하나를 옮기고 적절한 칼슘 염료로 30 분에서 1 시간 동안 적재하십시오. 12웰 플레이트의 뚜껑에 자체 제작 구멍(핫 18G 바늘)을 통해 카보게네이션 튜브를 삽입하여 로딩 용액을 지속적으로 카보게네이트합니다. 참고: 이 단계는 내인성 GCaMP와 같은 형광 기자를 내인성적으로 표현하는 유전자 변형 동물의 뇌 슬라이스 제제의 경우 필요하지 않습니다.</li>
	<li>6.2-6.5 단계에서 설명한 대로 레코딩 설정을 준비합니다. 참고: 미세 불피성 이미징 실험에는 증폭기 나 미세 조작기가 필요하지 않습니다. 자극기의 사용은 실험에 따라 다릅니다. 형광 이미징 실험을 위한 특정 소프트웨어는 필수적입니다.</li>
	<li>올바른 이미징 설정으로 소프트웨어를 조정합니다: 여기에는 카메라 증폭기 및 비닝 설정, 파장의 설정, 노출 시간 및 타이밍 프로토콜이 포함됩니다. 설정은 정확한 실험에 따라 다를 수 있습니다. (예시 흔적의 경우, 1 x 1 비닝, 2.4배 사전 증폭기 게인, 300 EM 카메라 게인, 488 nm에서 50ms의 노출이 실험 기간 동안 500ms마다 반복되었다.)</li>
	<li>칼슘 염료로 적재 한 후, 뇌 슬라이스 반구를 12웰에서 기록 챔버로 옮기고 현미경 단계에 배치합니다.</li>
	<li>6.7단계에서 설명된 것과 유사한 종이클립(그림 3A)또는 시판 가능한 뇌 슬라이스 그리드로 기록 챔버내의 슬라이스를 안정화한다.</li>
	<li>관심 영역이 올바른 현미경 분야와 초점에 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>형광 이미징 소프트웨어를 사용하여 슬라이스의 여러 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 참고: 광표백으로 인해 밝기의 일반적인 변동을 따르도록 전체 시야를 선택하는 것이 유용할 수 있습니다.</li>
	<li>레코딩을 시작하고 선택한 시점에서 실험 적 시험 약물을 적용하십시오. 참고: 각 실험의 끝에 높은 K+ 용액을 적용하여 세포의 신경 특성과 슬라이스 품질을 확인하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>적절한 파일 형식으로 데이터를 추출하고 전체 측정을 통해 ROI에서 발생하는 형광 신호 변화를 분석합니다. 오프라인 분석 중에 ROI를 조정할 수도 있습니다. 참고: 뇌 슬라이스에서 fEPSP 기록 및 칼슘 미세 불피계를 설명하는 다른 프로토콜은 문헌24,32,33,34, 35에서사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

신경 과학 지역 사회 중 일반적으로 사용 되 고 있지만, 두뇌 슬라이스 준비는 또한 몇 가지 단점에 직면. 예를 들어, 관심 있는 뇌 영역에 대한 입력 및 출력 연결은 더 이상 뇌 슬라이스에 연결되지 않습니다. 더욱이, 일단 고립되면, 조직은 시간이 지남에 따라 천천히 저하하기 시작하고이 과정은 뇌 슬라이스의 생리적 상태를 변경할 수 있습니다. 특히 이 주제는 대부분의 뇌 슬라이스 기록이 몇 분에서 몇 시간까지 걸리기 때문에 매우 우려되며, 이는 실험 시작 전에 6-8 h까지 격리 된 조직에서 수행 된 기록으로 긴 실험 일을 초래합니다. 또한, 뇌척수액과 혈액 순환은 슬라이스 준비 중에 중단되어 뇌 슬라이스 내의 중요한 내인성 화합물이 부족할 수 있습니다. 그리고 가장 명백하게, 슬라이스 절차 자체는 얻은 결과를 손상시킬 수 있는 기계적인 조직 손상을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 그러나, 뇌 슬라이스 준비의 실제 혜택은 여전히 그들의 단점을 능가, 그래서 그들은 높은 평가 및 신경 과학 연구에 사용 하는 기술을 제시.
급성 해마 뇌 슬라이스는 분자 수준에서 복잡한 뇌 회로 연구에 이르기까지 신경 과정을 조사하는 강력하고 널리 사용되는 기술을 제시합니다. 이것은 쉽게 슬라이스 준비에 보존 할 수있는 해마의 이상적인 신경해부학을 기반으로18. 따라서 해마 뇌 슬라이스는 약물 검진17,인지 기능40, 41,병리학적 뇌 질환 에 대한 조사(14,42,43)등 다양한 과학 연구 프로젝트에 사용된다. 그러나 다양한 응용 분야의 광범위한 응용 분야는 해부 조건 및 절단 평면 방향과 같은 다양한 매개 변수에서 다를 수 있는 광범위한 사용 가능한 슬라이스 준비 프로토콜을 발생시킵니다. 따라서 적절한 슬라이스 준비 프로토콜을 선택하려면 과학 프로젝트의 정확한 연구 문제를 결정해야 합니다.
티슈 헬기는 해마 뇌 슬라이스44,45를준비하기 위해 가장 오래된 사용 기술 중 하나를 제시한다. 이 준비 방법의 주요 장점은 헬기의 저렴한 비용과 빠르고 쉬운 사용(46)을포함한다. 그러나, 조직 헬기는 형태학적 변경 및 세포 사멸을 초래하는 기계적 스트레스를유발한다(47). 이에 비해 진동은 다소 비싼 기계이며 슬라이스 준비 시간이 크게 증가하여 슬라이스의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 진동은 일반적으로 조직에서 조각을 분리하는 보다 부드러운 방법을 제공하고 뇌를 전체 격리 절차를 통해 멋지게 냉각및 산소화하여 슬라이스특성(46)을개선할 수 있게 한다. 따라서, 몇몇 그룹은 표준적으로 이 기술을 채택하고 진동기16,30,48을사용하여 급성 해마 뇌 슬라이스의 제조를 위한프로토콜을앞으로 가져왔다. 일부 프로토콜은 슬라이스 자체에 대한 몇 가지 세부 사항만 제공하지만 오히려 이러한 슬라이스 준비(48)의특정 응용 프로그램에 초점을 맞추고 있지만, 다른 프로토콜은 절단 평면 또는 기타 프로토콜 세부 사항 (예 : 아가로즈 포함 또는 슬라이스 / 복구 솔루션)에서 다른 상세한 슬라이스 프로토콜을 제공합니다27,30.
여기에 설명된 프로토콜은 젊은 동물로부터 고품질급성 수평 해마 마우스 뇌 조각을 준비하기 위한 간단한 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 내측 피질에서 해마8,49,50으로진행되는 해마 입력 경로를 제시하는 천공 경로(내측 및 측면)를 보존하는 데 특히 유용하다. 궁수, 관상, 뿐만 아니라 고립 된 해마 가로 슬라이스 준비 제대로 천공 경로를 보존하지 않습니다, 이는 주로 층 II와 내측 피질의 V에서 유래 하 고 해마 내에서 여러 영역에 프로젝트18. 해마와 관련하여 내토경 피질의 해부학적 위치로 인해, 수평 뇌 슬라이스는 슬라이스제제(31)내에서 완전히 그대로 천포성 경로 섬유를 유지하기 위해 필수적이다. 또한, 수평 슬라이스는 이상적으로 해마9,30,50내에서 CA3 뉴런에 dentate gyrus에서 프로젝트 이끼 섬유를 보존한다. 따라서, 이러한 제제 방법은 해마 입력 경로 및 DG 관련 공정을 조사하는 연구를 위한 높은 가치이다. 또한,이 프로토콜은 쉐퍼 담보 경로(50)의조사를 허용한다. 그러나, 궁수 및 관상 동맥 두뇌 슬라이스 준비는 CA3에서 CA1 섬유 투영을 조사할 때 더 일반적으로 사용됩니다, 아마도 고품질 의 조각을 얻기의 기회를 증가시킬 수 있는 그들의 약간 더 빠른 준비 시간 때문일 수 있기 때문에. 그럼에도 불구하고, 수평 해마 슬라이스 준비는 하나의 슬라이스 반구 내의 모든 해마 섬유 경로의 보존 및 조사를 허용하기 때문에 강력한 연구 도구를 제시한다. 이는 회로 응답이 여러 전극 분석 기록과 같이 연구될 때 특히 유용할 수 있습니다.
뇌 조각을 준비할 때 주요 관심사는 뇌 조직의 적절한 보존입니다. 이는 빠른 해부, 조직의 연속및 충분한 산소화 및 냉각, 저나트륨, 고자당 슬라이스 용액39,51을이용한 보호 절단 방법을 사용하여 뇌 조직의 보호를 포함한 우리의 프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계에 의해 달성된다. 여기에 설명된 프로토콜이 약 90%의 성공률을 산출한다는 사실에도 불구하고, 나이가 많거나 유전적으로 다양한 동물에서 파생된 조직으로 작업하거나 특정 세포 인구를 보존하려고 할 때 잠재적으로 추가적인 보호 단계가 필요할 수 있습니다. 몇몇 방법은 이미 민감한 두뇌 조직 준비를 보호하기 위하여 보고되었습니다. 이러한 방법은 나트륨투과(52)를줄이기 위한 NMDG 기반 슬라이싱 용액의 사용, NMDA 수용체활성(53)을차단하기 위해 슬라이싱 용액에서 높은 마그네슘 수준을 사용하고, 또한 복구 기간 동안 보호 용액의 장기간 사용(23)을 포함한다. 이러한 모든 조치는 감소 된 흥분 독성을 초래할 것이다. 또한, 얼음 차가운 보호 ACSF 솔루션과 트랜스 카다이얼 관류는 종종 사용 되 고 오래 된 동물과 함께 작업 하는 경우 필요(27)
급성 해마 뇌 슬라이스는 상대적으로 두꺼운 (300-500 μm) 급성 뇌 슬라이스로부터 얻을 수있는 높은 진폭 신호와 같은 이유로 전기 생리학적 연구에 이상적으로 적합하고 광범위하게 사용되며, 이는 높은 신호 대 잡음비(11)를보장한다. 표준화적으로 사용되는 전기 생리학적 응용 분야는 전압 또는 전류 클램프 모드에서 세포외 필드 기록 및 세포 내 전세포 기록을 포함한다. 고품질 전기생리학적 데이터를 획득하기 위해 슬라이스 건강은 주요 관심사이며 제시된 프로토콜을 엄격하게 따르면 보장될 수 있다. 그러나 슬라이스 준비는 매우 민감한 기술을 제시하므로 각 실험이 시작되기 전에 품질 검사를 정기적으로 포함해야합니다. 여러 매개 변수는 슬라이스의 품질 검사로 사용할 수 있으며 입력 출력 곡선 및 기준선 fEPSP 또는 EPSC레코딩(19)을통해 표준적으로 평가된다. 그럼에도 불구하고, 최적 이하의 전기생리학적 특성은 전극 위치, 방향 또는 손상과 같은 실험적 오류에서 발생할 수 있으며 준비된 슬라이스의 건강만을 나타내지 않는다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 40배 목표 또는 DAPI 핵 염색하에서 세포의 간단한 시각화 및 평가와 같은 추가 품질 제어를 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 품질 검사는 여러 슬라이스 준비 세션을 통해 일정한 슬라이스 상태를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
칼슘 미세 불피성은 해마 뇌 슬라이스를 연구하는 데 덜 일반적으로 사용되는 기술을 제시합니다. 그러나, 이 기술은 표준 세포외 및 세포내 전극 기록에 추가적인 가치입니다, 그것은 신경 및 시냅스 신호에서 높은 중요성인 세포내 칼슘 플럭스를 시각화하고 정량화할 수 있기 때문에. 세포내 칼슘 농도의 변화는 신경 전달 물질 소포 방출, 포스트 냅틱 잠재적 인 생성, 시냅스 가소성 및 축삭 신경전도의 조절에 관여54,55,56. 이 기술의 그림으로(그림 4),우리는 시판되는 칼슘 염료를 사용했습니다. 틀림없이, 칼슘 염료를 가진 조직 조각의 처리는 더 낮은 위치신경 세포의 증가된 실험 시간 프레임 및 비효율적인 적재와 같은 어려움을 산출할 수 있습니다. 그러나 이 기술의 변형은 이러한 기술적 과제를 회피하는 데 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 해마 슬라이스에 칼슘 측정 및 패치 클램프 레코딩을 결합할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 칼슘 형광염은 패치 파이펫을 통해 특정 세포에 적재될 수 있어, 관심 있는 한 특정 셀에서 칼슘 역학의 측정을허용(57). 대안적으로, 칼슘 표시기를 표현하는 유전자 조작 동물, GCaMP58,전체 두뇌에서, 또는 세포 특정 promotor에 의해 구동되는, 이용될 수 있었습니다. 흥미롭게도, 관심있는 단백질에 직접 링커를 가진 GCaMP 동물에서 뇌 조직은 신경 발현 패턴을 결정하거나 칼슘 불꽃과 파도에 관여를 조사 할 수있는 기회를 제공 할 수 있습니다.
전부, 우리는 전기 생리및 화상 진찰 기록을 위한 마우스에서 건강하고 실행 가능한 수평 해마 두뇌 조각의 성공적인 준비를 위한 지침을 제공합니다. 이 방법론은 dentate gyrus에 기술된 두뇌 병리에서 생기는 신경학상 변경에 접근하는 것은 아주 유용합니다.

해마의 광범위한 탐구는 스코빌과 밀너가 심한 간질1에대한 치료로 해마와 인근 측두엽 구조의 외과 제거 후 새로운 선언적 기억을 형성하기 위해 환자 (H.M.)의 무능력을보고 했을 때 시작되었다. 그 순간부터 해마는 일반 뉴런 특성에서 부터 간질 및 알츠하이머 병2,3,4,5와같은 심각한 뇌 질환의 발달까지 광범위하게 연구되고있다. 해마는 감정과 기억 형성에 관여하는 관련 뇌 구조의 그룹으로 구성된 변연 시스템의 일부입니다6,7. 여러 섬유 통로의 조밀한 네트워크는 내부 및 외부 뇌 구조에 대한 엄격한 해마 연결을 달성합니다. 이러한 경로는 내측 및 측면 천포성 경로(내측 및 측면 천포성 경로(내측 성 피질- CA3 – CA1 및 subiculum)8,이끼 섬유 경로(DENtate gyrus to CA3)9 및 샤퍼 담보/협회 공동 통로(CA3 에서 CA1)10(도 1)을포함한다. 해마는 뉴런 층 형성의 매우 보존 된 라미나르 조직, 그리고 상대적으로 쉽게 중요한 신경 문화와 뇌 조각을 얻을 수있는 가능성5때문에 지금까지 가장 광범위하게 탐구 뇌 영역 중 하나를 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig01.jpg"> 그림 1: 다양한 해마 영역과 주요 섬유 경로를 보여주는 만화. 다른 해마 영역은 고체 색선으로 표시됩니다 : 내측 피질 (EC; 블랙), 덴테이트 자이러스 (DG; 오렌지), 코르누 암모니스 (CA) 3 (시안), 2 (노란색), 1 (마젠타), 및 체질 (녹색). 섬유 통로는 유색 점선으로 표시됩니다: 내측(MPP, 적색) 및 측면 천공경로(LPP, 파란색) (내톨리날 피질에서 덴테이트 자이러스, CA3, CA1 및 체큐럼까지), 이끼 섬유 통로(MF, 바이올렛) (덴테이트 자이러스에서 CA3까지) 및 샤퍼 담보(SC, 브라운) (CA3에서 CA1까지)/협회 쉼표 경로(AC, KR1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
두뇌 슬라이스 프로토콜은 종종 관심의 영역에 더 먼 뇌 영역에서 연결의 손실을 초래5. 더욱이, 모세혈관은 더 이상 기능성5이고 혈액 순환은11을박탈한다. 이러한 제한에도 불구 하 고, 두뇌 조각 여전히 주로 다양 한 장점으로 인해 해 마의 신경 생리 기능의 조사에 사용 됩니다. 첫째, 해마의 추출은 빠르며많은 물질이 필요하지 않습니다. 유일한 필수 기기는 해부 키트, 실험실 수조, 카보겐에 대한 액세스 및 진동 마이크로 토메 (진동)13을포함한다. 뇌 슬라이스 기술의 다른 자산은 실험시작 전내인성 방출 분자의 혈액-뇌 장벽(BBB)과 내인성 방출 분자의 세척이 5로, 비교적 정밀한 투여량조절(14)을가진 약물의 효과를 연구할 수 있게 한다. 더욱이, 뇌슬라이스는 해마15,16내의 사이토-아키텍처 및 시냅스 회로를 보존하며, 여기서 신경 해부학및 신경발달과 복잡한 뉴런-glia 상호작용이 있는 지역 환경은4,11,17로보존된다. 또한, 해마 섬유 연결은 주로 단방향및 해마 뉴런이 높은 시냅스 가소성을 가지며, 이는 신경학적 과정을 이해하기 위해 고품질 전기 생리학적 기록의 수집 및 해석을 엄청나게 단순화한다18,19. 중요한 것은, 뇌 슬라이스는 이미징 기록을 통해 분자 생물학적 기술에서 부터 전기 생리학적 측정12,20,21,22,23,24,25,26까지다양한 과학 기술에 적용할 수 있는 귀중한 자산을 제시한다.
위에서 설명한 바와 같이, 해마 뇌 슬라이스는 시냅스 연결의 구조적 및 기능적 특징을 연구하는 강력한 실험 도구를 제시합니다. 이것은 신경 흥분성 및 가소성에 화학 제품 또는 돌연변이의 효력을 평가할 기회를 제공합니다16.
급성 뇌 슬라이스 제제는 상대적으로 민감한 기술을 제시하고 최적의 슬라이스 품질은 동물의 나이, 안락사 방법, 해부 및 슬라이스의 속도, 슬라이스 솔루션 및 파라미터 (예를 들어, 슬라이스 속도)뿐만 아니라 슬라이스복구4를위한조건을 포함하여 이상적인 실험 조건에 크게 의존한다. 따라서 잘 설계된 프로토콜은 매우 중요하며 다른 연구단위(13)에걸쳐 재현성을 확보합니다.
여기서, 우리는 해마 측면 및 내측 천공 경로 및 이끼 섬유 통로의 무결성을 보존하기 위한 목적으로 급성 수평 해마 슬라이스 제제에 대한 상세한 프로토콜을 제공하여, 덴테이트 자이루스 관련 과정의 조사를허용하고 있다 9. 우리는 미세하게 해부, 추출 및 수평으로 뮤린 뇌를 슬라이스하는 주요 단계를 설명합니다, 칼슘 - 미세 불플루오리 메트릭 기록 및 필드 흥분 포스트 naptic 잠재적 기록의 대표적인 결과 다음 (fEPSP) 기준 조건하에서 및 야생 유형 C57BL / 6J 마우스의 뇌 조각에 LTP 유도 프로토콜 동안.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>home made - Generic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>plexiglas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer</td>
			<td>Dr&#228;ger &#38; MSS International Ltd</td>
			<td>Isoflurane Vapor 19.3 &#38; MSS Isoflurane</td>
			<td>to vaporize isoflurane for rodent anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrels for the perfusion system</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Hypodermic syringes without needle</td>
			<td>https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline methiodide</td>
			<td>hellobio</td>
			<td>HB0893</td>
			<td>https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate glass capillaries</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td>https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chlorid dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Imaging software</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>LiveAcquisition v2.3.0.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen tank</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>Alphagaz mix B50</td>
			<td>Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cluster microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>CE2C55</td>
			<td>https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (35 mm)</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353001</td>
			<td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon&#174;-Cell-Culture-Dishes/p/353001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (90 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11270-20</td>
			<td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-AP5</td>
			<td>hellobio</td>
			<td>HB0225</td>
			<td>https://www.hellobio.com/dap5.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16301</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&#38;region=BE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS camera</td>
			<td>HAMAMATSU</td>
			<td>ORCA-spark C11440-36U</td>
			<td>https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut&#174;/14058-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>hellobio</td>
			<td>HB0262</td>
			<td>https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon TM + DU-897E-CSO-#BV</td>
			<td>https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895278</td>
			<td>https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0818</td>
			<td>grade 413</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brush</td>
			<td>Raphael Kaerell</td>
			<td>8204</td>
			<td>Size #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf Fine-Ject</td>
			<td>18G X 1 1/2&#34; 4710012040</td>
			<td>https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>Iso-Vet 1000mg/g</td>
			<td>250 ml bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Henkel Adhesive technologies</td>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Super glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-10 with SM-7 remote control system</td>
			<td>https://www.luigs-neumann.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (for calcium imaging)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (for ephys recordings)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Examiner.A1</td>
			<td>https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope light source</td>
			<td>CAIRN Research</td>
			<td>dual OptoLed power supply</td>
			<td>https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&#38;region=BE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green&#174; 488 BAPTA-1</td>
			<td>Invitrogen Molecular Probes</td>
			<td>#06807</td>
			<td>10x50ug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td>5500 vapor pressure osmometer</td>
			<td>to verify osmolarity of salt solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Masterflex C/L 77120-62</td>
			<td>https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>WTW</td>
			<td>inoLab series pH 720</td>
			<td>https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chlorid</td>
			<td>Chem-lab</td>
			<td>CL00.1133</td>
			<td>https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade to prepare hemispheres</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>Safety Cartridge Dispenser - Pkg/10</td>
			<td>GEM Scientific Single Edge Razor Blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade for vibratome</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>121-6</td>
			<td>double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>home made - Generic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>to collect and store brain slices in (see details in manuscript)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Any company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver electrode wire</td>
			<td>Any company</td>
			<td></td>
			<td>for recording and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106342</td>
			<td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>14707</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/014707/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chlorid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for field recordings</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>PatchMaster</td>
			<td>https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9147-12EA</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&#38;region=BE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td>ISO-FLEX</td>
			<td>http://www.ampi.co.il/isoflex.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>102745C</td>
			<td>https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0167</td>
			<td>Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>800/100/200 &#38; 800/100/280</td>
			<td>Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>home made - Generic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 valve multi-barrel perfusion system</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic valves (to control the perfusion lines)</td>
			<td>NResearch Inc.</td>
			<td>p/n 161P011</td>
			<td>https://nresearch.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14912000001</td>
			<td>Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 7</td>
			<td>https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purification system</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Synergy millipore</td>
			<td>to obtain highly purified water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>CELLSTAR, 665180</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

horizontal hippocampal slices of the mouse brain

해마는 변반 시스템의 일부이며 알츠하이머 병과 간질을 포함한 심각한 뇌 질환의 증상뿐만 아니라 기억 형성 및 통합에 관여하는 뇌의 고도로 조직 된 구조입니다. 해마는 높은 수준의 인트라 및 상호 연결을 받아 내부 및 외부 뇌 구조와의 적절한 의사 소통을 확보합니다. 이러한 연결은 섬유 경로의 형태로 서로 다른 정보 흐름을 통해 수행됩니다. 뇌 조각은 해마의 신경 생리적 기능을 탐구 할 때 자주 사용되는 방법론입니다. 해마 뇌 슬라이스는 전기 생리학적 기록, 가벼운 현미경 측정뿐만 아니라 여러 분자 생물학적 및 조직화학 적 기술을 포함한 여러 가지 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 따라서, 두뇌 조각은 단백질 기능을 평가하기 위하여 이상적인 모형 시스템을 나타냅니다, 신경 장애에 관련된 병리학적인 프로세스를 조사하기 위하여 뿐만 아니라 약 발견 목적을 위해.
슬라이스 준비의 여러 가지 방법이 존재한다. 진동으로 뇌 슬라이스 제제는 조직 구조를 더 잘 보존하고 슬라이스 중에 충분한 산소 공급을 보장하며, 이는 조직 헬기의 전통적인 사용에 비해 이점을 제공합니다. 또한, 다른 절단 평면은 진동 뇌 슬라이스 준비를 위해 적용 될 수있다. 여기서, 마우스 두뇌의 진동 절단 수평 해마 조각의 성공적인 준비를 위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 다른 슬라이스 제제와는 달리, 수평 슬라이스는 내경-해마 상호 작용의 조사를 용이하게 하는 슬라이스 내의 완전히 그대로 상태로 해마 입력 경로(천포성 경로)의 섬유를 유지할 수 있게 합니다. 여기에서, 우리는 murine 두뇌의 해부, 추출 및 급성 수평 슬라이스를 위한 철저한 프로토콜을 제공하고, 이 기술의 도전 그리고 잠재적인 함정에 대해 토론합니다. 마지막으로, 우리는 추가 응용 프로그램에서 뇌 슬라이스의 사용에 대한 몇 가지 예를 보여줍니다.

프로토콜에 필요한 도구 및 중요한 단계에 대한 일반적인 개요 도 2는 이 프로토콜에 설명된 바와 같이 수평 급성 해마 뇌 슬라이스의 제조를 위한 필요한 모든 도구와 중요한 단계를 제시한다. 일반적으로, 몇 가지 해부 도구와 슬라이스 회수챔버(도 2A),실험실 수조 및 진동기(도2B)를포함하여 제한된 수의 주요 기기가 요구된다. 그림 2C-E는 슬라이스 준비 프로토콜 동안 뇌와 반구의 중요한 단계와 방향을 시각화합니다. 도 2F는 수평 뇌 슬라이스의 예상 결과의 예입니다.
내측 천공 경로의 fEPSP 레코딩 회복 기간 후, 뇌 슬라이스는 fEPSP의 전기 생리학적 기록에 사용될 수 있다. 여기서, 우리는 다중 채널 중력 제어 관류 시스템을 갖춘 직립 현미경을 사용했다(그림 3A 및 도 3B). 유리 마이크로피펫(~ 2MΩ)은 ACSF 용액으로 채워져 염소 처리된 목욕 전극으로 회로의 작동 증폭기에 장착된 염화물 코팅 은 전극 위에 부착되었습니다. fEPSP는 뇌 슬라이스의 상부 층에 있는 해마의 MPP에 유리 마이크로피펫을 삽입하여 증폭기 및 적절한 기록 소프트웨어로 기록및 시각화되었다. fEPSP는 2접촉 클러스터 마이크로전극을 통해 자극하여 유도되었고, 기록 전극의 MPP 상류에 상이한 전류 강도를 적용하였다. 이 프로토콜은 MPP 레코딩을 가져오는 방법을 설명하기 위한 것이 아니라 여기에 설명된 슬라이스 준비 프로토콜의 성공을 입증하기 위해 MPP의 레코딩을 예로 사용합니다. 누군가가 MPP 녹음을 수행하려고 시도하는 경우, 적절한 녹음 사이트를 보장하고 LPP8,36,37에서MPP를 구별하기 위해 특정 컨트롤 (예 : 페어링 펄스 녹음)이 필요할 수 있습니다.
도 3C는 fEPSP 레코딩의 음수(왼쪽 패널, 저품질 슬라이스) 및 양수(오른쪽 패널, 고품질 슬라이스) 예를 보여 줍니다. 음의 예 추적은 실제 fEPSP 진폭(≈0.5mV)보다 훨씬 높은 큰 섬유 배구(FV) 진폭을 나타낸다. 반면, 고품질 슬라이스 예제(오른쪽 패널)는 fEPSP 비율과 높은 fEPSP 진폭(>0.5 mV)에 대한 작은 FV를 나타낸다. 섬유 배구는 자극된 신경 섬유의 탈극성 시발생하므로 포스트냅성 전성(fEPSP)을 선행하는 신호이다. FV와 fEPSP 속성의 관계는 축산 및 시냅스 특성의 보존에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 그대로 신경 섬유를 가진 고품질 의 슬라이스는 FV 비율에 높은 fEPSP 진폭을 보여주어야 한다. 반대로, 전도 특성이 손상된 저품질 슬라이스는 FEPSP대 FV 비율이 감소합니다. 유사하게, 뇌 슬라이스의 생존가능성은 섬유 배막진폭(도3D)에비해 fEPSP 슬로프를 플로팅하여 분석할 수 있다.
또한, 입력 출력 곡선(자극 강도에 대한 fEPSP 경사 및 FV 진폭)은 슬라이스 품질을 결정하기 위해 표준적으로 사용됩니다. 이러한 곡선은 뇌 슬라이스에 증가 전류 자극을 적용하고 후속 fEPSP 응답을 모니터링하여 얻을 수 있습니다. 낮은 품질의 뇌 슬라이스는 제대로 보존되지 않은 뇌 조직의 최적이 아닌 전도 특성으로 인해 감소된 입력 출력 곡선을보여줍니다(그림 3E, F). 또한 시냅틱 프로세스를 검사하기 위해서는 이상적인 자극 강도 범위를 정의하기 위해 입력 출력 곡선이 필요합니다. 이상적으로, 자극 강도는 최대 응답을 위한 강도의 약 50%를 설정해야 합니다. 이 선택된 자극 강도에서, fEPSP 반응은 시냅스 가소성의 변화에 대해 매우 민감하며, 이는 장기적인 전위(LTP)와 장기 우울증(LTD)을 모두 조사할 수 있는 기회를 제공합니다.
시냅스 가소성을 연구하기 위해, 선택한 50% 자극 강도에서 뇌 슬라이스(fEPSP 슬로프)의 시냅스 전달은 컨디셔닝 단계 전에 더 긴 기간(보통 20-40분 사이)에 대해 모니터링된다. 실행 가능한 뇌 슬라이스는 안정적인 기준선을 가지며, 불안정한 기준선이 있는 뇌 슬라이스는 뇌 회로의 시냅스 가소성을 연구하기 위해 추가 컨디셔닝 프로토콜에 사용할 수없습니다(그림 3G,상부 패널). fEPSP 기준선 기록은 시냅스 전송 자체에 대한 약물 효과를 모니터링하기 위해유용할 수있다(도 3G,하부 패널). 기록된 fEPSP 기준신호의 평균은 일반적으로 fEPSP 시간 과정을 정규화하는 데 사용되며 표준적으로 100%로 설정됩니다.
시냅스 가소성은 뇌 슬라이스에 특정 컨디셔닝 프로토콜을 적용하여 연구할 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 조사된 뇌 회로 및 관심 메커니즘(예: LTP 또는 LTD)에 의존합니다. 덴테이트 자이러스의 MPP에서 LTP를 유도하기 위해서는 MPP 시냅스38에존재하는 강력한 GABAergic 억제로 인해 강력한 컨디셔닝 프로토콜이 필요하다. GABAergic 억제는 높은 자당 슬라이스 용액으로 준비 된 뇌 조각에서 더욱 두드러지는 것으로 보고 된다39. 여기서, GABAA 수용체 길항제 비쿠쿨린(그림3H)으로처리되는 동안 5분 간격으로 적용된 1s 긴 100Hz 펄스의 4개의 자극으로 구성된 프로토콜을 사용합니다. 컨디셔닝 기간 동안 NMDA 및 Bicuculline을 공동 첨가하면 LTP(도3H)가증가합니다. 슬라이스의 낮은 품질과 불안정한 시냅스 전송(fEPSP 기준선)은 LTP 및 LTD 유도가 변경되거나 실패할 수 있습니다. 따라서 고품질 슬라이스 제제와 함께 작업하고 엄격한 배제 기준(낮은 fEPSP 진폭 +3), 소형 fEPSP 경사(&0.5mV/ms) 또는 진폭(&0.5mV) 및 불안정한 fEPSP 기준(5% 이상 변경)을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 시냅스 프로세스를 조사할 때 실행 불가능한 슬라이스의 경우.
칼슘 미세 불피측정 측정은 축축자이루스의 과립 세포 층에서 측정 회복 후, 뇌 슬라이스는 빛으로부터 보호된 발보ASCF에서 1시간 동안 칼슘에 민감한 염료의 2μM로 실온에서 배양되었습니다. 슬라이스는 다중 채널 중력 제어 관류 시스템을 갖춘 직립 형광 현미경에 기록 챔버(도 3A)로전송되었다. 형광 방출 이미지는 488 nm(그림 4A, B)에서조명 후 500 밀리 초마다 획득되었습니다. 제논 램프와 스캐너 장착 회절 단색 단색을 장착하고 이미지 수집은 컴퓨터 제어 CCD 카메라로 수행되었다. 측정 하는 동안, 슬라이스는 NMDA 수용체 길항제 APV로 처리되었다, 이는 세포 내 칼슘 농도의 감소를 초래. 높은 칼륨 농도(50mMM)를 포함하는 세포외 용액을 가진 슬라이스의 자극은 뉴런의 탈극화 및 전압 게이트 이온채널(그림 4C)의개방으로 인해 세포외 칼슘의 대규모 유입을 초래하였다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>화합물</td>
			<td>농도(mM)</td>
			<td>분자량(g/mol)</td>
			<td>양(g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>25</td>
			<td>74.55</td>
			<td>1.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>20</td>
			<td>147.01</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>246.48</td>
			<td>2.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>12.5</td>
			<td>136.08</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 10 x 슬라이스 프리 솔루션(1 L).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>화합물</td>
			<td>농도(mM)</td>
			<td>분자량(g/mol)</td>
			<td>양(g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>나Cl</td>
			<td>125</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>2</td>
			<td>1 M CaCl2 솔루션에서</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>1</td>
			<td>에서 1 M MgSO4 솔루션</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4 * 2H2O</td>
			<td>1.25</td>
			<td>156.02</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>나에코3
</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>2.18</td>
		</tr>
<tr>
<td>포도당 * H2O</td>
			<td>25</td>
			<td>198.17</td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 1x ACSF (1 L) (305-315 mOsm 사이 의 진동).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>화합물</td>
			<td>농도(mM)</td>
			<td>분자량(g/mol)</td>
			<td>양(g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10배 슬라이스 표결의</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>자당</td>
			<td>252</td>
			<td>342.3</td>
			<td>21.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>나에코3
</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>포도당 * H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>198.17</td>
			<td>0.49</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 1x 하이자브로 슬라이스 용액(250mL) (320~325mOsm 사이 의 진동).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig02v3.jpg"> 그림 2: 수평 해마 뇌 슬라이스의 준비에 대한 자세한 정보. (A)설치류 뇌의 해부 및 슬라이스에 필요한 공구 이미지: (a) ±2cm 길이및 ±0.5cm 너비의 필터 용지 스트랩(예: 413) (b) 블레이드; (c) 슈퍼 접착제; (d) 파이펫 팁; (e) 시편 플레이트(진동과 함께 제공); (f) 35mm 배양 접시; (g) 미세 브러쉬; (h) 주걱; (i) 곡면 집게; (j) 해부 가위; (k) 강한 가위 (10cm 이상의 블레이드 길이); (l) 넓은 개구부를 가진 플라스틱 파스퇴르 파이펫 (직경0.6 ~0.8cm) (m) 회수 실 (250 mL 비커, 플라스틱 링, 나일론 메쉬, 10 mL 세로지학적 파이펫 조각으로 자수); (n) 차가운 문화 요리 위에 얼음과 (o) 필터 종이 사각형으로 채워진 90mm 문화 요리. (B)얼음으로 채워진 슬라이스 챔버의 (a) 홀더와 진동의 그림; (b) 슬라이스 챔버; (c) 카보겐 라인과 (d) 슬라이스 면도날. (C)수평 슬라이스에 대한 뇌를 준비하기 위해 한 반구의 등쪽의 절단 방향을 보여주는 만화(3.9단계 참조). (D)진동의 표본 판상에서 뇌 방향의 이소메트릭 투영. (E)표본판에 있는 두 반구의 위치의 맨 위 뷰를 보여주는 만화. (F)수평 뇌 슬라이스에서 해마의 위치를 보여주는 만화. 해마의 규명 자이러스(DG)와 코르누 암모니스(CA)-수비쿨럼(SB) 부위가 표시된다. (G)갓 슬라이스된 10개의 수평 뇌 슬라이스를 함유한 CARSF가 있는 회복실의 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig3v5.jpg"> 그림 3: 해마 뇌 슬라이스의 전기 생리학적 기록. (A)수직 현미경으로 사용되는 관류 및 흡입이 있는 녹음 챔버의 이미지. 뇌 슬라이스는 챔버에 배치되고 녹음이 시작되기 전에 종이 클립 조각으로 고정됩니다. (B)직립 현미경 (10x 목표)에서 해마 뇌 슬라이스의 밝은 필드 사진. 상기 덴테이트 자이러스(DG) 및 CA3 영역은 fEPSP 레코딩 중 내측 천공성 경로를 표적으로 하는 자극(왼쪽 아래) 및 기록(아래 아래) 전극뿐만 아니라 표시된다. (C)왼쪽: 견고한 섬유 발리와 작은 진폭을 가진 fEPSP 레코딩의 저품질 슬라이스 예제의 표현. 오른쪽: fEPSP 레코딩의 고품질 슬라이스 예제입니다. 회색 선은 기준선을 나타냅니다. 점선은 0.5mV의 컷오프 진폭을 가리킵니다. (D)fEPSP 경사의 플롯과 FV 진폭대 고품질(블랙; n=10) 및 저품질 뇌 슬라이스(회색; n=4). 고품질 슬라이스(블랙; n=10) 및 저품질 슬라이스(회색; n=4)에 대해 상이한 자극 강도(μA)에 대한 평균 ±SEM.(E)입력 출력 플롯(fEPSP 경사)으로 표현되는 데이터. (F)(E)와동일하지만 FV 진폭에 대 자극 강도. (G)3개의 다른 기준선 fEPSP 레코딩의 시간 과정(fEPSP의 경사는 %; 처음 5분의 평균 fEPSP 경사로 정규화). 상부 패널은 양수(검정) 및 음수(red) 예를 나타내며, 여기서 후자는 기록 중에 카보겐이 생략되어 불안정한 기준선이 있다. 하부 패널은 처리된 두 개의 안정적인 기준선 기록(안정된 기준선 20분 후, AMPA 수용체는 AMPA 수용체 길항제 DNQX(10 μM)의 적용에 의해 차단되었다) (파란색) 및 처리되지 않은 상태(black). (H)상이한 치료 조건에 대한 LTP 기록의 시간 과정 (낮은 패널로 표시). 컨디셔닝 중 비큐컬린(20 μM)을 적용하기 위한 검은색과 컨디셔닝 중 비큐컬린(20 μM)과 NMDA(10μM)를 공동 적용하기 위한 파란색. 상부 패널의 화살표는 고주파 자극이 적용된 시간 점을 나타냅니다(100Hz의 4 x 1s). 아래 패널의 막대 그래프는 평균 fEPSP 경사(%) 상부 패널에 도시된 실험의 LTP 유도 후 50-60분 동안(각 조건에 대한 단일 대표 기록). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig3v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig04.jpg"> 그림 4: 해마 뇌 슬라이스의 칼슘-미세불피량. (A 와 B)형광 이미지(488nm에서 흥분)(A)및 마우스 뇌의 수평 해마 뇌 슬라이스의 해당 열지도(B). 덴테이트 자이러스(DG), CA3 지역, 및 관심 영역(ROI)의 예는 패널 A.(C)NMDA 수용체 길항제 APV(50 μM)를 치료하는 동안 급성 해마 뇌 슬라이스의 dentate gyrus에서 ROI로부터 칼슘 반응(F488 nm)의시간 과정 및 높은 외세포 칼륨(K+m)을포함하는 용액에 표시된다. 추적은 높은 K+ 관류 동안 가장 높은 칼슘 반응으로 정규화되고 광표백을 위해 기준선 수정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain at JoVE.com

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

horizontal-hippocampal-slices-of-the-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K 조회수.  KU Leuven. 이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

비디오: Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological impairments 1. Two pervasive and disabling symptoms experienced by TBI survivors, memory deficits and a reduction in seizure threshold, are thought to be mediated by TBI-induced hippocampal dysfunction 2,3. In order to demonstrate how altered hippocampal circuit function adversely affects behavior after TBI in mice, we employ lateral fluid percussion injury, a commonly used animal model of TBI that recreates many features of human TBI including neuronal cell loss, gliosis, and ionic perturbation 4-6.
	Here we demonstrate a combinatorial method for investigating TBI-induced hippocampal dysfunction. Our approach incorporates multiple ex vivo physiological techniques together with animal behavior and biochemical analysis, in order to analyze post-TBI changes in the hippocampus. We begin with the experimental injury paradigm along with behavioral analysis to assess cognitive disability following TBI. Next, we feature three distinct ex vivo recording techniques: extracellular field potential recording, visualized whole-cell patch-clamping, and voltage sensitive dye recording. Finally, we demonstrate a method for regionally dissecting subregions of the hippocampus that can be useful for detailed analysis of neurochemical and metabolic alterations post-TBI.
	These methods have been used to examine the alterations in hippocampal circuitry following TBI and to probe the opposing changes in network circuit function that occur in the dentate gyrus and CA1 subregions of the hippocampus (see Figure 1). The ability to analyze the post-TBI changes in each subregion is essential to understanding the underlying mechanisms contributing to TBI-induced behavioral and cognitive deficits. 
	The multi-faceted system outlined here allows investigators to push past characterization of phenomenology induced by a disease state (in this case TBI) and determine the mechanisms responsible for the observed pathology associated with TBI.

A multi-faceted approach to investigating functional changes to hippocampal circuitry is explained. Electrophysiological techniques are described along with the injury protocol, behavioral testing and regional dissection method. The combination of these techniques can be applied in similar fashion for other brain regions and scientific questions.

가벼운 외상성 뇌 손상 후 Hippocampal 회로 기능의 수선에 관한 조사

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A large share of ATP is needed to re-install ion gradients across plasma membranes degraded by electrical signaling of neurons. There is evidence that astrocytes - while not generating fast electrical signals themselves - undergo increased production of ATP in response to neuronal activity and support active neurons by providing energy metabolites to them. The recent development of genetically encoded sensors for different metabolites now enables the study of such metabolic interactions between neurons and astrocytes. Here, we describe a protocol for cell-type specific expression of the ATP-sensitive Fluorescence Resonance Energy Transfer- (FRET-) sensor ATeam1.03YEMK in organotypic tissue slice cultures of the mouse hippocampus and cortex using adeno-associated viral vectors (AAV). Furthermore, we demonstrate how this sensor can be employed for dynamic measurement of changes in cellular ATP levels in neurons and astrocytes upon increases in extracellular potassium and following induction of chemical ischemia (i.e., an inhibition of cellular energy metabolism).

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

We describe a protocol for cell-type specific expression of the genetically encoded FRET-based sensor ATeam1.03YEMK in organotypic slice cultures of the mouse forebrain. Furthermore, we show how to use this sensor for dynamic imaging of cellular ATP levels in neurons and astrocytes.

FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 ATP 이미징

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...