우리는 기술 지원을 위해 로체스터 의료 센터의 대학의 전자 현미경 연구의 핵심 시설에 연동 펌프와 vibratome의 사용뿐만 아니라, 카렌 L. 벤틀리와 게일 슈나이더에 대한 Shao - 명나라 루 해리스 A. Gelbard 감사합니다. 이 작품은 NIH (EY019277), 화이트홀 재단, 버로우즈 웰컴 기금과 AKM에 알프레드 P. 슬로안 재단의 기금에 의해 투자되었다. M.-È.T. 퐁 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ) 박사 교육 수상에 의해 후원됩니다.

1. 동물 재관류 <ol><li> 재관류 전날에 준비 : - 인산염 버퍼 2 패 (PB, 100 MM, 산도 7.4) 및 나트륨 1 L 인산염 버퍼 호수 (PBS를, 0.9 % 50 MM PB에 NaCl, 산도 7.4)을 두 번 증류수 인치 4 PB의 PBS와 1L ° C.를 저장 이들은 재관류 및 사전 삽입의 immunocytochemistry에 사용됩니다. - 6 생쥐의 재관류를 가능하게 4.0 %의 paraformaldehyde의 1L (PFA, 산도 7.4) 정착액 솔루션. 그 목적을 위해, 가열 퓸 후드 아래에 PB 1 패 있습니다. 세분화된 paraformaldehyde (PFA)의 40g의 무게를하고 60 ° C.에 도달하면 PB 솔루션에 따르다 솔루션은 4 실온 (RT)과 저장하는 시원한 PFA 완전히 용해, ° C.으로 명확하면 </li><li> 재관류의 날, 퓸 후드 아래의 PB에 3.5 %의 acrolein 솔루션 500 ML을 준비합니다. 그런 다음, 3.5 % acrolein와 필터 용지를 사용하여 4.0 % PFA 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 마우스 마취 들어, 27 게이지 ½ &quot;바늘과 복막에 (80 MG / kg) 나트륨은 pentobarbital 주입. </li><li> 재관류 동안, PBS 50 ML은 acrolein의 75 ML 및 PFA 150 ML은 순차적으로 마우스 순환에 전달합니다. 연동 펌프를 설정하려면, PBS로 튜브를 기입 한쪽 끝에 23 게이지 어 &quot;나비 바늘을 수정. 재관류 솔루션 (PBS, acrolein 또는 PFA)에 관의 다른 쪽 끝을 담가. 연동의 속도를 설정 20-25 ML / 청소년 및 성인 쥐에 대한 분에 펌프. 재관류 동안 조심스럽게 튜브의 성형 공기의 거품을하지 마십시오. </li><li> anaesthetized 마우스가 더 이상 같은 꼬리 핀치로 통증 자극에 반응하지 않을 때까지 계속 진행하기 전에, 잠깐 만요. 절개 트레이에 동물을 배치하고 테이프를 사용하여 발 수정. 족집게와 가위로, 피부와 마음을 노출 흉강을 엽니다. 뇌 국소 빈혈을 최소화하려면, 재관류가 빠르게 시작되어야합니다. 작은 가위로 오른쪽 아트리움을 열고 잘라 연동 펌프를 시작합니다. 핀셋으로 마음을 잡고 있지만, 좌심실의 꼭대기에 나비 바늘을 삽입합니다. </li><li> 솔루션을 변경하면, 연동 펌프를 중지 해결책이 하나에서 다른 튜브를 전송하고, 즉시 펌프를 다시 시작합니다. </li><li> PFA 150 ML이 통과되면, 연동 펌프를 중지합니다. 작은 가위를 사용하여, 머리를 잘라 껍질을 열고 눈 사이 두개골을 깰. 두뇌가 쉽게 제거할 수있을 때까지 머리 작은 조각에서 신중하게 칩을 작은 핀셋을 사용합니다. 4에서 2 시간 동안 머리를 포스트 수정 ° PFA에서 C. PBS로 3 회 10 분 씻으십시오. </li><li> 즉시 vibratome를 사용하여 얼음 냉각 PBS에서 가로의 두뇌 (50 μm의 두께 부분)을 잘라. 좋은 브러시로 PBS를 포함하는 유리관에 immunocytochemistry에 대해 선택한 섹션을 전송합니다. 몇 년 최대 cryoprotectant에서 -20 ° C (30 % 에틸렌 글리콜과 PBS에 30 % 글리세롤)의 나머지 부분을 저장합니다. </li></ol> 2. 사전 퍼가기의 immunocytochemistry <ol><li> immunocytochemistry 들어, 섹션은 자유롭게 유리 튜브에 떠있 처리됩니다. 절차 전반에 걸쳐, 하나주의 깊게 섹션 밖으로 건조시키는 않도록해야합니다. </li><li> 첫째, 전송 피펫을 사용하여 PBS를 제거하고 즉시 RT 30 분 PBS에 0.​​1 %의 나트륨 borohydride의 새로운 솔루션으로 대체합니다. </li><li> 모든 거품을 제거, PBS 3 회 십분와 섹션을 씻어하고, 0.5 젤라틴 %와 보조 항체가 생성된있는 동물의 5 % 정상 혈청 (정상 염소 혈청에를 포함하는 PBS의 차단 솔루션 RT에서 2 시간 동안 부화 Iba1 - immunostaining의 현재 예). </li><li> 솔루션을 차단의 기본 항체를 48 시간 동안 부화. Iba1 - immunostaining 들어, 토끼 방지 Iba1 항체 (1:1000)를 사용합니다. </li><li> PBS 3 회 십분와 섹션을 씻어 RT에서 2 시간 동안 솔루션을 차단에 비오틴을 복합 이차 항체 (1:1000)에 품어. Iba1 - immunostaining 들어, 염소 방지 토끼 IgGs를 사용합니다. </li><li> PBS 3 회 십분와 섹션을 씻어 RT에서 1 시간 동안 솔루션을 차단에 streptavidin - 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (1:1000)에 품어. </li><li> PBS 십분와 트리스 / HCL - 버퍼 식염수에 섹션 린스 (TBS, 50 MM, 산도 7.4)은 2 번 10 분 거리에 있습니다. 레이블을 표시하려면, 0.05 %의 DAB와 TBS에서 0.01 %의 과산화수소 (신선한 솔루션)와 섹션을 품어. 얼룩이 (그림 1 예 참조) 어두운 갈색 때, TBS에서 rinsing하여 반응을 중지합니다. 어떤 경우에는 5 분 최대 후 반응을 종료합니다. TBS 십분과 PB 2 배 십분와 섹션을 씻어. </li></ol> 3. 전자 현미경에 대한 처리 <ol><li> 좋은 브러쉬를 사용하여 multiwell 문화 판에서 PB로 섹션을 전송합니다. 발연 후드 아래의 PB에 1 % 오스뮴의 tetroxide 솔루션을 준비합니다. 문화 판의 우물에서 PB를 제거하고<html> 좋은 브러시로 평면 섹션을 확산. RT 30 분 1 % 오스뮴에 즉시 몰두 섹션. </li><li> 유리 튜브에 섹션을 전송, PB 3 회 십분와 린스, 그리고 에탄올의 농도 상승으로 2 분 immersions 통해 탈수 : 2 곱하기 35 %, 1 회 50 % 각각 70 %, 80 %, 90 %, 및 95 %, 3 회 프로필렌 산화물 다음 백퍼센트 3 회. </li><li> Durcupan 수지를 준비하려면, 색상 균일 될 때까지, 구성 요소 B의 20g, 구성 요소 C의 0.6 g, 그리고 일회용 비이커에 구성 요소 D의 0.4 g이 잘 혼합 구성 요소 20g을 결합하고, 무게는 알루미늄에 따르다 요리. 필요한 경우, 수지 블록 금형을 삽입하고 48~72시간을위한 55 ° C 오븐에서 경화에 수지를 따르고으로 준비하실 수 있습니다. </li><li> 프로필렌 산화물과 씻어서 좋은 브러시를 사용하여 RT에서 밤새 함침에 대한 Durcupan 수지로 프로필렌 산화물과 담가에서 섹션을 제거합니다. </li><li> 다음날, 알루미늄은 수지를 약화시키기 위해 10 분 동안 55 ° C 오븐에 요리를 넣어 무게. 프로필렌 산화물, 코팅 수지의 얇은 레이어와 ACLAR 퍼가기 필름과 씻어서 브러쉬를 사용하여 다른 퍼가기 영화로 커버하고, 골고루 (; 예 : 유리 튜브의 플라스틱 뚜껑을 위해 g 약 2) 가벼운 무게를 배포 섹션을 내려 놓 아라 위에 수지가 확산을 도울 것이다. 수지 중합 들어, 48~72시간에 대한 오븐 (55 ° C에서)에서 알을 품다. </li><li> 중합 후 섹션의 상단에 빛이 가중치 및 삽입 필름을 제거합니다. 쌍안경 현미경, 관심있는 사각형 영역을 (2x2 mm 정도)를 선택하고 면도날을 사용하여 영화에서 신중하게 소비세. </li><li> 접착제는 Superglue를 사용하여 수지 블록의 끝에 관심 영역 1 시간 동안 55 ° C 오븐에 치료. </li><li> sectioning 준비에서 면도날과 이등변 사다리꼴의 형태에 수지 블록을 잘라. </li><li> ultramicrotome 및 유리 칼을 사용하여 조직의 표면에서 접착제와 수지를 제거합니다. 더블 증류수와 함께 유리 칼의 보트를 입력하고 몇 반 얇은 섹션 (0.5-1 μm의 두께) 했네요. </li><li> 완벽한 루프와 SuperFrost 슬라이드 섹션을 전송합니다. ° C 1 분 80 열판에 슬라이드를 삽입하여 섹션을 건조. 1 분 0.1 % toluidine 파란색 얼룩 (2g의 나트륨 borate 200 ML 더블 증류수 0.2 g toluidine 파란색)의 몇 방울로 커버. 더블 증류수로 얼룩 초과를 씻어. 가벼운 현미경으로 섹션의 심사는 수지 (그림 2)에서 스테인드 조직을 구별할 수 있도록합니다. </li><li> 조직과 수지의 경계는 부분의 중앙에 도달할 때까지 절단 이력서. 다음 절차는 훈련이 필요합니다. 다이아몬드 칼로 유리 칼을 교체하고 두 번 증류수로 배를 채우십시오. 실버 - 골드 ultrathin 섹션 (60-80 nm의 두께)에 은색을 잘라 조심스럽게 좋은 거꾸로 핀셋을 사용하여 구리 메쉬 그리드에 그들을 수집합니다. 필터 종이에 그리드를 건조시킵니다. </li><li> 콘트라스트를 향상시키기 위해, ultrathin 섹션은 리드 구연 산염 (10 ML 더블 증류수 1 0.03 g 리드 구연 산염 및 0.1 ML 10N 수산화 나트륨) 물들일 수 있습니다. 좋은 거꾸로 핀셋을 사용하여 2 분 동안 리드 구연 산염의 드롭에 격자를 전송합니다. 격자를 제거하고 정교한 이중 증류수 3 연속 목욕탕에서 씻어. 마지막으로, 필터 종이에 그리드를 건조하고 전자 현미경 검사 (그림 3-6)까지 그리드 상자에 저장합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 빛의 미세한 수준에서 Iba1 묻은 섹션을 참조하십시오. Iba1의 세포 분포는 immunostaining의 특이성을 보여줍니다 microglia로 제한됩니다. 스케일 바 = 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="그림 2" /> 빛의 미세한 수준에서 그림 2. Toluidine 푸른 스테인드 세미 얇은 섹션을 참조하십시오. immunostaining은 전자 현미경에서 가장 강렬 나타납니다 조직과 수지의 경계를 적어 둡니다. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="그림 3" /> 전자 현미경 수준에서 Iba1 - immunopositive microglial perikaryon 및 프로세스를 보여주는 그림 3. Ultrathin 섹션. Iba1 - 긍정적인 구조 요소들​​은 immunoperoxidase - DAB 전자 - 밀도 침전물로 인정받고 있습니다. 스케일 바 = 2 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="그림 4" /> 전자 미세한 수준에서 서로 다른 크기와 모양의 Iba1 - immunopositive microglial 프로세스를 표시하는 그림 4. Ultrathin 섹션. 스케일 바 = 2 μm의. E 5 &quot;/&gt; 그림 5. 그 세포 organelles의 식별을 가능하게 높은 배율의 그림 4에서 Iba1 - 긍정적인 microglial 과정을 보여주는 Ultrathin 섹션. 스케일 바 = 1 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="그림 6" /> 높은 배율에서 Iba1 - 긍정적인 microglial 프로세스와 시냅스를 포함한 neuropil 주변 요소 사이의 ultrastructural 관계를 드러내는 그림 6. Ultrathin 섹션. 스케일 바 = 1μm.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기 우리는 최적의 ultrastructural 보존 및 절차 엄격하게 수행됩니다 immunocytochemical 감지, 사이 좋은 타협을 제공 immunoelectron 현미경에 대한 마우스 뇌 조직의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. TEM과 결합,이 방법은 몇 가지 독특한 기능과 식별 기준으로 세포 요소를 구분할 수 있습니다. 특히, Iba1의 immunoperoxidase - DAB의 얼룩은 neuropil 내에 microglial perikarya 및 프로세스를 식별...

* 하나는 항상 퓸 후드 아래의 작업과 acrolein, paraformaldehyde, 그리고 오스뮴 처리 또한 적절하게 자신의 폐기물의 처분해야 할 때 nitrile 장갑을 착용해야합니다.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

전송 전자 현미경 (TEM)은에서 중추 신경계에 microglial, oligodendrocytic astrocytic와의 연결을 subcellular 구획 (dendrite, 돌기 척추, 축삭, 축삭 터미널, perikaryon),뿐만 아니라 자신의 세포 organelles과 cytoskeleton을 시각화를위한 매우 유용합니다 높은 공간 해상도. 로 표시, TEM과 결합하여, 사전 퍼가기의 immunocytochemistry는 몇 가지 독특한 기능과 식별 기준 (예, microglial perikarya 및 프로세스, microglia 특정 마커 Iba1 (이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 하나에 대한 항체를 사용하는 경우와 세포 요소의 차별을 허용 여기에)), 신경 전달 물질의 세포 요소의 내용 (예 : serotonergic) 및 ultrastructural 가용성이나 멤브레인 - 바운드 단백질의 지방화 (예 : 5 HT1A 및 EphA4 수용체)를 식별. 여기, 우리는 acrolein 정착액, 뇌 섹션의 sectioning 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라 immunoperoxidase - diaminobenzidine (DAB) 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin와 생쥐의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 TEM과 시험 준비가되었습니다. 엄격하게 수행하는 경우,이 기술은 최적의 ultrastructural 보존과 immunocytochemical 검출 사이 좋은 타협을 제공합니다.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

우리는 두뇌 섹션 sectioning 마우스, 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라, immunoperoxidase의 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 전송 전자 현미경과 함께 시험에 대한 준비가되었습니다.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.7K 조회수.  University of Rochester. 우리는 두뇌 섹션 sectioning 마우스, 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라, immunoperoxidase의 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 전송 전자 현미경과 함께 시험에 대한 준비가되었습니다.

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

연구

신경과학

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in preparation for detailed downstream analysis such as flow cytometry or single-cell sequencing. Neural dissociation can be conducted via mechanical dissociation (such as using filters, chopping techniques, or pipette trituration), enzymatic digestion, or a combination thereof. The delicate nature of neuronal cells can complicate efforts to obtain the highly viable, true single-cell suspension with minimal cellular debris that is required for single-cell analysis. The data demonstrate that this combination of automated mechanical dissociation and enzymatic digestion consistently yields a highly viable (&gt;90%) single-cell suspension, overcoming the aforementioned difficulties. While a few of the steps require manual dexterity, these steps lessen sample handling and potential cell loss. This manuscript details each step of the process to equip other laboratories to successfully dissociate small quantities of neural tissue in preparation for downstream analysis.

This neural cell dissociation protocol is intended for samples with a low amount of starting material and yields a highly viable single-cell suspension for downstream analysis, with optional fixation and staining steps.

마우스 뇌 해마 조직의 기계적 및 효소적 해리 결합

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

Deep-Tissue Three-Photon 형광 현미경 검사 in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Superior Colliculus의 Two-photon 및 Wide-field Calcium 이미징

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

저자 스포트라이트: Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...