이 작품은 NIH 그랜트 P20 RR021905 - 01, CF RPD 부여 STANTO07R0, 그리고 NASA 부여 NNH09ZNE002C에 의해 후원됩니다.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 세균성 휘발성 물질의 SESI - MS 분석을위한 도식. 세균성 문화의 상부는 SESI 반응 챔버 (2)에 CO 2 (1)에 의해 전이됩니다. 휘발성 물질들은 전기 분무 구름을 통과 SESI 반응 챔버를 통과하고 (3) 이온화되기로. 일단 이온화, 휘발성 물질은 분석을 위해 질량 분석계 (4)에 연루됩니다. 초과 캐리어 가스 및 휘발성 물질 unreacted 세균성 보호의 추가 조치로, 0.22 μm의 필터 (5)를 통과하고, 화학 후드로 배출됩니다. 삽입된 페이지 : SESI의 전기 분무 니들이 날카롭게 바늘 끝과 함께 (40 μm의 ID가) 모세관 실리카이다. 세균 휘발성 물질, E.의 특성화를위한 SESI - MS의 사용 시범으로 대장균 K12와 P. 녹농균이라는 박테리아의 PAO1는 37 50 ML LB - 레녹스 24 H에 대한 aerobically 양식 아르 ° C와 상부의 휘발성 물질의 SESI - MS 스펙트럼은 2 분 후에 수집하고 있습니다. 2 L / 분 유동 속도로 이산화탄소 (99.99 %)는 반응 챔버에 휘발성 배달 캐리어 가스로 사용됩니다. SESI 반응 챔버 사용자 정의했습니다 지어진 원래의 전기 분무 이온 소스를 대체 API - 3000 (SCIEX)에 장착되어. 스펙트럼은 0.1 % 개미 산성, 5.0 %의 메탄올 및 전기 분무 솔루션으로 94.9 %의 물 (V / V)를 사용하여 긍정적인 이온 모드에서 수집한 5 전달됩니다 날카롭게 바늘 끝과 모세관 비 전도성 실리카를 통해 NL / S (40 μm의 ID가). 인가 전압 2.5 KV입니다. - 500 다, MCA 모드, 40 검사, 3 S / 스캔하고, 2 분 총 분석 시간이 20 : 분석 1.4.2 소프트웨어 (응용 Biosystems)는 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 데이터 수집에 사용됩니다. 1. Culturing 시스템 <ol><li> 실험 (예, 통기, 빛, 온도, 등)뿐만 아니라 질량 분석기로 휘발성 물질의 효율적인 전달에 수종의 성장 요구 사항을 고려하여 문화를 성장에 해당하는 선박을 선택합니다. 우리가 사용하도록 선택할 문화 병 적어도 두 luer 포트가 스레드 모자가 장착되어 표준 100 ML Pyrex 미디어 병입니다. 입구 라인 캐리어 가스 샘플 병에 전달 및 콘센트 라인이 악기에 VOC 배달 (그림 1)에 대해 다른 포트를 통해 삽입 한 luer 포트를 통해 삽입됩니다. 추가 포트 연결됩니다. </li><li> 이전 culturing 샘플을 위해 누수를 확인하기 위해 물에 선박과 잠수함의 기압. 가스 누출이 약하거나 결석 휘발성 이온 신호의 형태로 비정형 결과의 주요 원인이됩니다. </li></ol> 2. 생물학 실험 : 설정과 안전 고려 사항 <ol><li> 귀하의 가설에 적합한 조건에서 문화를 성장. 그것은 적어도 두 생물 학적, 각 두 기술은 복제, 복제 각 변수에 대해 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 모든 문화 조건에 대한 빈 준비 (중간, 항생제 등) 및 샘플과 동일한 조건에서 공백으로 품어. </li><li> 고려 종족의 biosafety 레벨 (들)을 데리고, 당신이 사용하는 생물 학적 에이전트에 적합한 안전 조치를 사용합니다. </li><li> 악기 및 가능한 생물 학적 에이전트와 가스 이송 라인의 오염을 방지하기 위해, 캐리어 가스 라인에 적절한 기공 크기의 필터를 설치합니다. 필터는 SESI 반응 챔버에 휘발성 물질의 전송에 방해가되지 않겠지만 약간 에어로졸 전송의 효율성에 영향을 수 있습니다 6. </li><li> 생물 학적 대리인이 밝혀 지던의 경우에 적절한 봉쇄을 보장하여 문화 병에 가스 전송 뚜껑을 부착하면 보조 억제 또는 biosafety 캐비닛을 사용합니다. </li><li> 시작하고 병 내부의 압력을 빌드하지 않습니다 방식으로 샘플 병에 캐리어 가스 흐름을 종료할 수 있습니다. </li></ol> 3. 악기 최적화 참고 : SESI - MS가 특별히 샘플 휘발성 물질하도록 설계되었습니다 때문에 악기를 사용하기 전에 향기로운 개인 관리 항목 (예 : colognes, 구강 세척제, 로션, 섬유 유연제), 껌, 담배 등의 사용을 제한할 수 있습니다. 단단히 연구실의 모든 휘발성 화학 물질 모자, 제어 공기는 테스트 기간 동안 최대한 임시 보관함. 모든 신호 강도 및 안정성에 영향을 미치는 다음과 같은 수단 매개 변수, 악기 및 실험을위한 최적화해야합니다. <ol><li> 전기 분무 솔루션과 유량이 : 계정으로 운영 악기 극성 (긍정적이거나 부정적인 이온 모드) 및 대상 화합물의 분자 특성을 복용, 당신이 목표하고자하는 분자의 클래스에 해당하는 전기 분무 솔루션을 선택합니다. 이 실험에서는 전기 분무 솔루션은 0.1 % 개미 산성, 5.0 %의 메탄올, 이하 극지 분자의 신호 강도를 향상 94.9 %의 물 (V / V)입니다 whil좋은 신호 안정성을 제공하는 전자. 솔루션 5 NL / s의의 흐름 속도 제공됩니다 </li><li> 캐리어 가스 유량 : 캐리어 가스 유량은 전기 분무의 안정성과 신호 강도에 영향을 줄 수 있습니다. 2 L / 분 유량에서 CO 2 (≥ 99.99 %)이 여기에 사용됩니다. </li><li> 니들의 모양과 위치는 : 바늘 팁 형상과 위치는 강력하게 신호 강도 및 안정성에 영향을 미칩니다. 새로운 바늘을 설치할 때 바늘의 위치가 낮은 배경, 높은 analyte 신호 강도, 및 신호 안정성 사이의 균형을 만들 최적화해야합니다. 바늘 변경 후 SESI 스펙트럼를 재현하기 위해서, 그것은 당신이 당신의 기록에 관찰된 스펙트럼을 일치시킬 수있을 때까지 당신이 바늘 위치를 조정으로 주기적으로 검사 결과를 수집하는 것이 필요합니다. 질량 분석 오리피스에 전기 분무의 바늘 끝의 거리는 1 것입니다 - 5mm. </li><li> 적용 전압 : 시스템에 적용되는 전압 신호 이온 강도 및 전기 분무 테일러 원추의 안정성에 영향을 미칩니다. 또한, 최적의 전압은 전기 분무 솔루션과 바늘 팁 형상에 의존적일 수 밖에 없습니다. 실험의 시리즈의 시작 부분에서, 사용중인 시스템에 대한 최적의 스펙트럼 및 신호 안정성을 산출 전압을 결정하고 이후의 모든 실험이 전압을 사용합니다. 우리 시스템, 2.0의 적용 전압 - 5.0 KV는 최적의 신호 강도와 전기 분무의 안정성을 제공합니다. 본 실험에서는 2.5 KV이 사용됩니다. </li></ol> 4. 켜기 및 분석을위한 SESI - MS 조정 <ol><li> 전압 공급 장치가 해제되어 있고 시스템이 전기의 방전입니다함으로써 시작합니다. 전압 공급 장치의 표시등이 점등이 0 멀티미터에서 전압을 보장), 2에서, 그리고 3) 전기 접지 리드를 보장 1)하여이 문제를 마십시오. </li><li> 실험에 적합한 전기 분무 솔루션을 설치합니다. </li><li> 캐리어 가스를 켜고 및 실험을위한 적절한 속도로 흐름을 설정합니다. </li><li> 반응 챔버에 전기 분무 솔루션의 제공을 시작하는 전기 분무 저수지에 압력을 적용합니다. </li><li> 전압 공급 켜고 및 실험을위한 적절한 값을 전압을 조정합니다. </li></ol> 참고 :이 시점에서 이온화 소스의 금속 표면은 위험한 충격을 전달할 수 있습니다. 전압 공급 장치가 켜져되었습니다 일단 악기 주위 작업시 큰주의. <ol start="6"><li> 적용 전압 미세 조정 조정을하는 동안 SESI - MS 스펙트럼을 모니터링을위한 튜닝 방법을 설정합니다. 귀하의 시스템과 실험에 최적화된 것으로 인수 매개 변수를 사용합니다. 모든 검사가 독립적인 스펙트럼을 생산 있도록 다중 채널 수집 (MCA) 확인란을 (해당되는 경우) 지우기, 10 수집 시간을 설정할 수 - 15 분, 그리고 인수를 시작합니다. 캐리어 가스 배경의 스펙트럼 이제 관찰해야합니다. </li><li> 이전 실험에 대한 CO 2 검색과 일치하는 안정된 총 이온 크로마토 그램 (TIC)와 재현성 스캔을 얻기 위해 적용 전압 미세 조정 조정을합니다. 전압 조정되었습니다되면, 악기가 안정화되도록 5 분 동안 스펙트럼과 TIC를 수집 진행합니다. </li><li> 일단 기기의 안정성이 필요한 경우, 인수 시간을 조정 데이터 범위 및 MCA 선택하여 샘플에 맞게 수집 방식을 설정 보장합니다. 기록에 대한 캐리어 가스 배경 스펙트럼을 수집합니다. </li></ol> 5. 당신의 세균성 문화의 휘발성 지문을 구하기 <ol><li> 빈 스펙트럼을 수집하기 위해 우회 회선을 통해 운반 기체 흐름을 직접, 그리고 악기의 가스 전송 라인 (밸브 폐쇄) 빈 샘플을 첨부합니다. </li><li> 샘플 병에 밸브를 열고 우회 라인의 밸브를 닫습니다. </li><li> 시스템이 반응 챔버의 습도가 안정화되는 시간 동안, 30 초 동안 평형 수 있습니다. 평균의이 기간은 재현성 스펙트럼을 얻기 위해 필수적입니다. 시스템이 equilibrated 있는지 확인하려면 평균 기간 동안 변경됩니다 TIC를 모니터링하고자하고, 이후 안정 수 있습니다. </li><li> 시스템이 equilibrated되면, 스펙트럼 수집을 시작합니다. </li><li> 스펙트럼이 수집되면, 먼저 다음 샘플 밸브를 폐쇄, 캐리어 가스 바이패스 라인을 개방하고, 마지막으로 샘플 병을 제거하여 샘플 병을 제거하십시오. , 전송 라인에서 수분과 adsorbed 휘발성 물질을 제거 샘플 - 투 - 샘플 carryover를 방지, 4 분 - 2 캐리어 가스와 함께 시스템을 플러쉬. </li><li> 간헐적으로 철저한 빈 뺄셈을 보장하기 위해 추가적인 빈 스펙트럼을 수집, 각 세균의 샘플에 대해 5.5 - 5.2 단계를 반복합니다. 불완전한 빈 뺄셈은 이어질 것입니다대기압 이온화 기술에 공통적으로있는 귀하의 처리 스펙트럼의 화학적 배경 봉우리의 모양 (예, phthalates, 실리콘 등) 9. </li><li> 당신의 검사 결과를 수집하면, 이온 신호로 TIC 및 개별 봉우리의 최대 강도에 의해 결정 악기의 선형 검출 한계를 초과하지 않도록하십시오. 악기의 감지기의 위쪽 한계를 초과하는 이온은 샘플을 대표하지 않습니다 유물의 봉우리를 생성할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 SESI - MS 스펙트럼의 예를으로이 세균 휘발성 물질, E.에 대한 긍정적인 이온 모드 휘발성 지문을 얻을 수 있습니다 대장균 및 P. 37 24 H에 대한 LB - 레녹스에 aerobically 재배 녹농균이라는 박테리아는 ° C (그림 2) 표시됩니다. E. 대장균 휘발성 스펙트럼은 M / Z = 118에서 인돌에 의해 지배되어 이것은 E.에게 제공 콜리 문화 P.의 스펙트럼 반면, 자신의 특성 냄새, 녹농균이라는 박테리아는 protonatable 봉우리의 큰 다양성을 포함하고 있습니다. 휘발성 스펙트럼의 봉우리의 상대적인 농도가 제 3에 설명되어있는 수단이 매개 변수에 의존하는주의하시기 바랍니다. 이러한 매개 변수는 단단히 재현할 수 스펙트럼을 얻기 위해서는 실험에서 실험을 제어해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 새 - 빼는 긍정적인 이온 모드 SESI - MS 스펙트럼 (20~150미터 / Z). E.의 대장균 K12와 P. 37 LB - 레녹스 24 H 에어로빅 성장 후 녹농균이라는 박테리아 PAO1 휘발성 물질을 ° C. SESI 스펙트럼에서 관찰 봉우리에 대한 자세한 내용을 보려면, Zhu, 외. 8 참조하십시오.

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	<li>Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESI-MS+in+the+analysis+of+trace+species+in+gases.">ESI-MS in the analysis of trace species in gases.</a> , (1999).</li><li>Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+ion+mobility+spectrometry/mass+spectrometry+of+illicit+drugs.">Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs.</a> Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).</li><li>Tam, M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization-ion+mobility+spectrometry+for+explosive+vapor+detection.">Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection.</a> Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).</li><li>Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+(SESI)+of+ambient+vapors+for+explosive+detection+at+concentrations+below+parts+per+trillion.">Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+detection+of+human+skin+vapors.">On-line detection of human skin vapors.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+volatiles+in+breath.">Electrospray ionization of volatiles in breath.</a> Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F., F, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+fatty+acid+vapors+in+breath+by+electrospray+ionization+and+atmospheric+pressure+ionization-mass+spectrometry.">Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008).</li><li>Guo, X. H., Bruins, A. P., Covey, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+typical+chemical+background+interferences+in+atmospheric+pressure+ionization+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).</li><li>Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A., Johnson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathogen detection using headspace analysis. , 16-16 (2004).</li><li>Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M., Rieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+bacteria+in+vitro+by+mass+spectrometric+fingerprinting:+A+pilot+study.">Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study.</a> Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).</li><li>Schulz, S., Dickschat, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+volatiles:+The+smell+of+small+organisms.">Bacterial volatiles: The smell of small organisms.</a> Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).</li><li>Ligor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+breath+investigation.">Analytical methods for breath investigation.</a> Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).</li><li>Cao, W. Q., Duan, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breath+analysis:+Potential+for+clinical+diagnosis+and+exposure+assessment.">Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment.</a> Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).</li><li>Law, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+complex+viscous+liquids+at+the+molecular+level.">Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+analytes+from+cheese+products+for+fast+detection+using+neutral+desorption+extractive+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).</li><li>Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+organic+compounds+in+foods:+A+five+year+study.">Volatile organic compounds in foods: A five year study.</a> J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).</li><li>Calkins, C. R., Hodgen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+meat+flavor.">A fresh look at meat flavor.</a> Meat Sci. 77, 63-80 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

박테리아는 박테리아 식별 10-12과 신진 대사 상태의 평가를 위해 활용할 수있는 휘발성 물질의 다양한 조합을 생산하고 있습니다. SESI - MS 방법은 여기서 설명하는 것은 급속하게 종족의 식별을위한 박테리아 &quot;지문&quot;을 생성하는 샘플 준비를하지 않고 박테리아 휘발성 물질을 (두 분 이내에) 특성화하는 수단을 제공합니다. 지난 몇 십년 8 다른 대기압 이온화가 MS의 기술은 선택적 이온 유동 튜브 (선별)과 프로톤 전달 반응 (PTR) 질량 분광법을 포함한 휘발성 화합물의 특성에 적용되었습니다. SESI이 다른 이온화 방법을 통해 제공하는 독특한 장점은 복합 식별을위한 중요한 도구입니다 조각 구체적인 봉우리 (SESI에 맞게 조정될 수 있습니다 질량 분석기의 적절한 유형을 제공) 할 수있다는 것입니다. 우리는 위에 나열된 프로토콜의 정상 분열을 해결하지만, 조각화 정보는 세균 휘발성 물질의 특성에 사용할 수있는 방법의 예를 들면, 외, Zhu을 참조하시기 바랍니다 않았 8. SESI - MS 숨을 분석을 통해 세균성 폐 감염의 현장 검출에 직접 응용 프로그램을 가지고 있지만, 휘발성 샘플링이 가능합니다 어느 설정에도 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 신진 대사 질환의 진단에 관련된 소변, 혈액 및 호흡에 휘발성 물질의 분석은 위장 질환, 암, 및 환경 노출은 잘 SESI - MS에 적합합니다. 13,14 SESI - MS도있다 , 숙성 노화, 또는 망치고과 관련된 특성 휘발성 물질에 대한 식품의 신속한 분석을 포함하지 않은 임상 VOC 지문 애플 리케이션의 광범위한. 15-18

<table border="1"><tbody><tr><td> 재료 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> API - 3000 트리플 Quadrupole </td><td> 기계 </td><td> SCIEX </td><td></td><td> 분석 1.4.2 (응용 Biosystems)로 구입 </td></tr><tr><td> SESI 이온 소스 </td><td> 기계 </td><td></td><td></td><td> 사용자 정의 - 만든, 참조 참조 6 </td></tr><tr><td> 가스 유량계 </td><td> 장비 </td><td> 콜 - 파머 </td><td> EW - 03217-74 </td><td></td></tr><tr><td> 이산화탄소 </td><td> 장비 </td><td> Airgas </td><td> CD I300 </td><td> ≥ 99.99 % 순도 </td></tr><tr><td> 질소 </td><td> 장비 </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> 초고 순도 </td></tr><tr><td> 100 ML 유리 미디어 병 </td><td> 장비 </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45 나사 나사 </td></tr><tr><td> luer 포트가있는 병 뚜껑 </td><td> 장비 </td><td> 바이오 화학 Fluidics </td><td> 00945T - 3 </td><td> 캡 어셈블리 </td></tr><tr><td> Luer 포트 플러그 </td><td> 장비 </td><td> 바이오 화학 Fluidics </td><td> 009LP </td><td> 캡 어셈블리 </td></tr><tr><td> 튜브 1 / 4 &quot;(OD) × 1 / 8&quot;(ID) </td><td> 장비 </td><td> 콜 - 파머 </td><td> EW - 95875-02 </td><td> 캡 조립 및 가스 이송 라인 </td></tr><tr><td> 관 1 / 8 &quot;(OD) × 16분의 1&quot;(ID) </td><td> 장비 </td><td> 콜 - 파머 </td><td> EW - 06605-27 </td><td> 캡 어셈블리 </td></tr><tr><td> 투 - 웨이 밸브 </td><td> 장비 </td><td> 콜 - 파머 </td><td> 07391-04 </td><td> 캡 어셈블리 </td></tr><tr><td> 필터, 학년 AAQ </td><td> 장비 </td><td> 발스톤 필터 </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> 개미의 산, LC / MS 등급 </td><td> 시약 </td><td> 어부 </td><td> A117 - 05AMP </td><td> 전기 분무 용액 </td></tr><tr><td> 메탄올, LC / MS 등급 </td><td> 시약 </td><td> 어부 </td><td> A456 - 500 </td><td> 전기 분무 용액 </td></tr><tr><td> 물, LC / MS 등급 </td><td> 시약 </td><td> 어부 </td><td> W6 - 500 </td><td> 전기 분무 용액 </td></tr></tbody></table>

characterizing bacterial volatiles using secondary electrospray ionization mass spectrometry (sesi-ms)

보조 전기 분무 이온화 질량 분석계 (SESI - MS)는 샘플 전처리가 필요없이, 휘발성 화합물의 신속한 감지를 위해 개발된 방법입니다. 방법은 먼저 펜 및 동료 1 설명되었으며 불법 마약 2 폭발물 3-4, 피부 휘발성 물질 5 특성과 호흡 6-7의 분석의 검출에 적용되었습니다. SESI 이온화는 전기 분무 솔루션과 휘발성 analyte 사이 프로톤 전달 반응에 의해 발생하고, 마찬가지로 전통적인 전기 분무 이온화 (ESI)에, 이종 유기 분자의 분석에 따라서 적합합니다. 그러나, 표준 ESI 달리 SESI의 프로톤 전송 과정은 솔루션의 기상 단계보다는 (그림 1)에서 발생하고, 따라서 SESI 유기 휘발성 물질과 에어로졸 검출에 가장 적합합니다. 우리는 박테리아 식별 및 특성 8 방법으로 세균 휘발성 물질의 검출에 SESI - MS의 이용을 확대하고 있습니다. 우리는 통계 분석 방식과 결합된 SESI - MS 휘발성 지문이, 성장 매체의 다양한 세균 장군, 종, 그리고 혼합 문화를 차별화하는 데 사용할 수있는 것을 증명하고있다. 8 자 SESI을 사용하여 박테리아 휘발성 지문을 취득하는 단계를 제공합니다 강력한 박테리아 식별 및 특성화를 위해 최적화되어야 수단 매개 변수를 포함 - MS.

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Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

보조 전기 분무 이온화 질량 분석계 (SESI - MS)은 샘플 전처리가 필요하지 않고 휘발성 유기 화합물 (휘발성 유기 화합물)의 검출이 가능합니다. 이 프로토콜은 SESI - MS를 사용하여 세균 휘발성 유기 화합물의 급속한 (분 이내) 특성화하기위한 지침을 제공합니다.

보조 전기 분무 이온화 질량 분석법 (SESI - MS)를 사용하여 특성화 세균 휘발성 물질

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

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Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

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비디오: Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

연구

생체공학

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

탈착 전기 분무 이온화 질량 분석에 의한 생물 조직의 이미지

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3 차원 세포 배양 모델의 질량 분석 이미징을위한 준비 전략 샘플

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

비행 시간 형 질량 분석과 2D 가스 크로마토 그래피를 사용하여 조류의 열수 액화에서 수성 분수의 질적 특성

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

적외선 매트릭스 보조 레이저 탈착 전자 분무 이온화에 의한 전신 질량 분석 이미징 (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

아메바를 사용 하 여 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 결과

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...