우리는 기술 지원과 자금 조달 (S. Schwarzbach 호텔) 및 지원 (K. Spragens, T. 그레이엄)의 USGS 서부 생태 연구 센터 M. 비천한 사람과 아이다호 기술의 R. 크리 스프 감사하고 싶습니다. 국방부와 공군 연구소의학과 지원 국방 및 국토 안보부 (www.idhs.org) 연구소 - 본 연구는 혁신적인 기술을위한 센터의 후원하에 수행되었다. 동물 처리는 미국 지질 조사국 서양 생태 연구 센터와 연구소를 Banding 미국 지질 조사국 버드의 허가의 동물 케어 및 사용위원회의 승인 절차를 따랐다. 이 간행물의 무역, 제품 또는 회사 이름의 사용은 설명용으로만 사용되며, 미국 정부에 의해 승인을 의미하지는 않습니다.

1. 미스트 그물을 사용하여 야생 조류 캡처 <ol><li> 쇼어 버드 캡처 들어, 마시, ​​해안, 또는 머드 플랫과 같은 적극적인 식량 약탈을 배워 현장에서 미스트 그물을 설정합니다. </li><li> 슬라이드 트레멀 라인 극 주변 미스트 그물의 한쪽 끝을의 루프와 진흙으로 수직 막대기를 삽입합니다. </li><li> NET을 당겨 미스트 네트의 다른 끝에 트레멀 루프를 통해 초 장대를 삽입하고 수직으로 트레멀 라인이 진행되었는지 만들기, 진흙에 장대를 삽입합니다. </li><li> 새가가 캡처되면 네트워크에서 새를 추출하고 banding 역으로 돌아갑니다. </li></ol> 2. Cloacal 면봉 샘플링 <ol><li> 즉시 캡처 후 cloacal 면봉를 수집 </li><li> 배설강을 찾아 주변 깃털을 다시 밀어 손가락을 사용하여 </li><li> 멸균 Dacron 또는 폴리에스터 - 스쳐 면봉 포장을 푸는 먼저 끝 줄기와 보라고 더욱 쉽게 살균 바이러스성 전송 매체와 팁을 축축하게하다. moistening 후, 면봉의 전체 머리를 부드럽게 하수구에 삽입됩니다. 천천히 면봉을 휘두르네 및 하수구에서 면봉을 제거하여 하수의 면봉은 내부 원주. </li><li> 직접 바이러스 수송 미디어 샘플 약병에 면봉의 팁을 삽입, 면봉은 미디어에있는 동안 엄지와 집게손가락 사이에 면봉으로 샤프트를 회전. 면봉 팁은 유리병에 남아와 샤프트가 방해하지 않도록 조교는 가위로 ~ 1cm 유리병의 바닥에서 면봉을 다시의 팁을 당기는하여 절차를 완료하고 면봉의 샤프트를 차단 캡 폐쇄. 단단히 캡 유리병. 면봉 샤프트를 절단 사이에 알코올로 가위를 소독. </li><li> 드라이 아이스이나 얼음 팩을 중 하나를 포함하는 냉동실 상자에 튜브를 삽입합니다. </li></ol> 3. Oropharyngeal 면봉 샘플링 <ol start="1"><li> choanal 짧게 볼 수 있도록 부드럽게 새의 부리를 열고 </li><li> 패키지에서 깨끗한 면봉 포장을 푸는 먼저 끝 줄기와 보라고 더욱 쉽게 바이러스성 전송 매체와 팁을 축축하게하다 </li><li> 다른 표면에 끝을 건드리지 않고, 입 및 면봉으로 입안의 지붕에있는 choanal 오프닝에 삽입하고 oropharyngeal 또는 인후 지방쪽으로 계속 </li><li> 직접 바이러스성 전송 미디어 약병에 면봉의 끝을 놓으십시오. 면봉이 미디어에있는 동안 엄지와 집게손가락 사이에 면봉으로 축을 회전. 위와 같이, 지원자가 ~ 1cm 유리병의 바닥에서 면봉을 다시의 팁을 뽑아 면봉 팁은 유리병에 남아와 샤프트가 뚜껑에 방해가되지 않도록 가위로 면봉의 샤프트를 차단 폐쇄. 단단히 캡 유리병. 면봉 샤프트를 절단 사이에 알코올로 가위를 소독. </li><li> 드라이 아이스 또는 얼음 팩이 들어있는 냉장고 상자에 튜브를 삽입합니다. </li></ol> 4. 버드 처리 및 릴리스 <ol start="1"><li> 적시 (&lt;20mins)에서 캡처 및 릴리스의 사이트에 새를 반환합니다. 처리기는 동물 복지의 원칙을 인식하고 샘플링하는 동안 고통 조류의 징후 (예 : 찰과상, myopathy 및 하이포 또는 고열을 캡처)에 대한 경고해야합니다. 기본적인 구급 상자가 장비 목록에 포함되어야합니다. </li></ol> 5. 시험 시설 <ol start="1"><li> 샘플은 PCR 장치와 연결된 컴퓨터를 실행하는 전원 공급 장치 (전압 - 규제 발전기)와 같은 연구 트레일러 또는 십t 같은 밀폐된 공간에서 테스트할 수 있습니다. </li></ol> 6. RNA 추출 <ol start="1"><li> RNA 추출은 스팩맨 외 다음과 같은 제조 업체의 지침을 약간 수정 RNeasy 미니 키트와 함께 수행했다. 1 </li><li> 소용돌이 면봉의 3-5 s에 대한 중간 및 2 ML의 microcentrifuge 관 350 μl를 전송. 참고 : PCR 양성 샘플 rescreened 또는 H5 테스트를 실행해야 할 필요 경우에 얼음에 남은 샘플 보관하십시오. </li><li> 350 RLT 버퍼의 μl (β - 나와 함께) 5 S.위한 소용돌이 추가 </li><li> RNA 학년 70 % 에탄올 350 μl를 추가합니다. </li><li> 5 분 5,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 2 ML 수집 관에 위치 스핀 컬럼에 뜨는 600 μl를 추가합니다. 테스트 튜브 랙의 나머지 샘플을 보유합니다. </li><li> 흐름 -을 통해 10,000 XG 및 폐기 20 s에 대한 원심 분리기. </li><li> 모든 샘플은 스핀 열의 통과 때까지 반복 17-18 단계를 반복합니다. </li><li> 깨끗한 2 ML 수집 튜브의 스핀 열의를 놓습니다. </li><li> 스핀 컬럼에 RW1 버퍼 700 μl를 추가하고 10,000 X G. 25 s를 원심 분리기 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 10,000 X G. 25 S에 대한 스핀 컬럼 및 원심 분리기 500 μl RPE 버퍼를 추가합니다 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> RPE 버퍼 두 세척 총 22 단계를 반복합니다. </li><li> 14,000 X G.시 추가 2 분 스핀 컬럼을 원심 분리기 수집 튜브를 폐기하십시오. </li><li> 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 스핀 컬럼을 장소와 nuclease없는 물 50μl를 추가합니다. 60 S. 위해 상온에서 알을 품다 </li><li> 10,000 xgf 60 s에 대한 회전에 의해 Elute RNA또는 60 S. 이곳은 얼음에 샘플을 정화. </li></ol> 7. 부정적인 컨트롤을 준비 <ol start="1"><li> 동결 건조된 시약은 TaqMan 프로브의 인플루엔자 대상 1 (ASAY - ASY - 0109)에 대한 아이다호 기술 프리즈 건조 시약 감지 키트의 지침에 따라 PCR 분석에 사용하기 위해 준비되었습니다. </li><li> 알약은 하단에되도록 3 s에 대한 부정적인 제어 시약의 약병 (적색)을 원심 분리기. </li><li> 뚜껑을 제거, 시각적으로 확인 알약은 하단에서 확인하십시오. </li><li> 2 X의 Reconstitution 버퍼 20 μl 시약 학년 워터 20 μl를 추가합니다. </li><li> 최대 속도에서 5 s에 대한 요점을 되풀이하고 와동. </li><li> 유리병의 바닥에 액체 가지고 3 s에 대한 원심 분리기. </li><li> 시각 단계 31-32를 반복하지 않을 경우 펠렛가 rehydrated있다 확인하십시오. </li><li> Lightcycler 모세관에 수산화 혼합물의 피펫 19 μl는 중복을 얻기 위해 두 번째 모세관에 피펫의 단계를 반복합니다. </li></ol> 8. 준비 테스트 샘플 <ol start="1"><li> 알약은 하단에되도록 3 초에 대한 미지의 시약의 약병 (파란색)을 원심 분리기. </li><li> 뚜껑을 제거, 시각적으로 확인 알약은 하단에서 확인하십시오. </li><li> 정화 RNA 40 μl를 추가합니다. </li><li> 최대 속도에서 5 s에 대한 요점을 되풀이하고 와동. </li><li> 유리병의 바닥에 액체 가지고 3 s에 대한 원심 분리기. </li><li> 시각 단계 38-39를 반복하지 않을 경우 펠렛가 rehydrated있다 확인하십시오. </li><li> Lightcycler 모세관에 수산화 혼합물의 피펫 19 μl는 중복을 얻기 위해 두 번째 모세관에 피펫의 단계를 반복합니다. </li></ol> 9. 긍정적인 컨트롤을 준비 <ol start="1"><li> 알약은 하단에되도록 3 s에 대한 긍정적인 제어 시약의 약병 (녹색)을 원심 분리기. </li><li> 뚜껑을 제거, 시각적으로 확인 알약은 하단에서 확인하십시오. </li><li> 2 X의 Reconstitution 버퍼 20 μl 시약 학년 워터 20 μl를 추가합니다. </li><li> 최대 속도에서 5 s에 대한 요점을 되풀이하고 와동. </li><li> 유리병의 바닥에 액체 가지고 3 s에 대한 원심 분리기. </li><li> 시각 단계 45-46를 반복하지 않을 경우 펠렛가 rehydrated있다 확인하십시오. </li><li> Lightcycler 모세관에 수산화 혼합물의 피펫 19 μl는 중복을 얻기 위해 두 번째 모세관에 피펫의 단계를 반복합니다. </li></ol> 10. 모세관 튜브를 Centrifuging <ol start="1"><li> 일단 배치를위한 모세관 튜브의 모든 모세관 어댑터가 장착되어 미니 원심 분리기로 그들을 로드할 준비가되었습니다. </li><li> 1 S. 위해 아래 펄스 버튼을 누른 가장 낮은 설정에서 원심 분리기 이것은 테스트를 위해 준비에있는 바닥에 액체 전달합니다. </li></ol> 11. 빠른 작동 <ol start="1"><li> 새 파일을 만듭니다. 분류 긍정적인 제어, 부정적인 제어 및 샘플 (자신의 ID 번호에 의해). </li><li> 프로그램 1 : RNA 샘플 준비 잡아 <ol><li> 사이클 = 1 </li><li> 분석 모드 = 없음 </li><li> 대상 온도 = 40 </li><li> 부화 시간 = 30 분 </li><li> 온도 전환 속도 = 20 ° C / 초 (기본값) </li><li> 보조 온도 대상 = 0 (기본값) </li><li> 스텝 크기 = 0 (기본값) </li><li> 단계 지연 = 0 (기본값) </li><li> 수집 모드 = 없음 (기본값) </li></ol></li><li> 프로그램 2 : RNA 변성 <ol><li> 사이클 = 1 </li><li> 분석 모드 = 없음 </li><li> 대상 온도 = 94 </li><li> 부화 시간 = 120s </li><li> 온도 전환 속도 = 20 ° C / 초 (기본값) </li><li> 보조 온도 대상 = 0 (기본값) </li><li> 스텝 크기 = 0 (기본값) </li><li> 단계 지연 = 0 (기본값) </li><li> 수집 모드 = 없음 (기본값) </li></ol></li><li> 프로그램 3 : RNA의 증폭 <ol><li> 사이클 = 45 </li><li> 분석 모드 = 자동 분석 </li><li> 목표 온도, 세그먼트 1 = 94; 세그먼트 2 = 60 </li><li> 배양 시간, 세그먼트 1 = 0의, 세그먼트 2 = 20 S </li><li> 1 &amp; 2 독방 감금 온도 전환 속도 = 20 ° C / S (기본값) </li><li> 보조 온도 대상, 독방 감금 1 &amp; 2 = 0 (기본값) </li><li> 단계 크기, 독방 감금 1 &amp; 2 = 0 (기본값) </li><li> 단계 지연, 독방 감금 1 &amp; 2 = 0 (기본값) </li><li> 취득 모드 = 없음 세그먼트 1; 세그먼트 2 = 싱글 </li></ol></li><li> 형광 매개 변수 <ol><li> 형광 채널 2 (Ch2 / 1) 모드를 표시합니다 이득 : <ol><li> 채널 1 (F1) = 1 </li><li> 채널 2 (F2) = 8 </li><li> 채널 3 (F3) = 1 </li></ol></li><li> 각 샘플에 대한 실시간 형광 데이터를 표시하려면, 관심의 샘플을 선택하고 화면의 하단에있는 &#39;보기 그래프&#39;버튼을 클릭 </li></ol></li><li> 각 모세관 경우, 결과는 다음과 같습니다 : <ul><li> # - 회전 목마의 회전 목마 위치를 식별 </li><li> 샘플 이름 - 샘플의 이름을 제공합니다 </li><li> 제어 - 각 샘플에 대한 샘플 유형을 indentifies </li><li> 점수 - 샘플에서 샘플의 형광 배경 형광의 수준 사이의 관계를 사용하여 계산 </li><li> 결과 - 샘플에 대한 전체 결과를 표시합니다 </li></ul></li></ol> 12. 대표 결과 : 현재 : 시험 / 미지의 시료에 대한 빨간색 &#39;현재&#39;통화 대상 해당 샘플에서 확인 및 제어가 성공했음을 나타냅니다. 감지되지 않음 : 테스트 / 알려지지 않은 샘플에 대한 녹색 &#39;발견되지 않음&#39;통화 대상 해당 샘플에서 발견하고 테스트 컨트롤이 성공 않았음을 나타냅니다. 반복하십시오 : &#39;하시기 바랍니다 반복&#39;는 긍정적이거나 부정적인 제어가 실패했음을 나타냅니다. 빠른 7,200에 의해 성공적인 분석의 예제는 그림 4에 표시됩니다. 긍정적인 컨트롤은 증폭과 약 25 사이클 (X 축)에 감지 형광 (Y 축)을 생성합니다. 사이클 임계값 (CT)&gt; 35 동의 컷 - 오프 가장 AIV 참조 실험실입니다. 따라서,이 방법에 대한 긍정적인 컨트롤 AIV 감지주기의 접수 번호 (0-35) 이내에 형광 신호를 생산. 반면, 부정적인 제어도 45 사이클 후 형광 신호를 생성하지 않습니다. 마찬가지로, 서쪽 샌드 파이 퍼스에서 수집한 열두 샘플 새들이 AIV에 대한 부정적인 것을 나타내는 형광 신호를 생성하지 않았다. 전통적인 실험실에있는 모든 긍정적인 샘플의 후속 테스트는 거짓 반응이 잘못 생성되지 않도록하는 것이 좋습니다입니다. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig1.jpg" alt="그림 1" /> 미스트 그물을 사용하여 그림 1. 쇼어 버드 캡처. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 이상 샌드 파이 퍼스에서 cloacal와 oropharyngeal 샘플의 수집. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. RNA의 증폭에 대한 신속한 7200을 프로그래밍. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 신속한 7200 휴대용 RRT - PCR은 긍정적이고 부정적인 컨트롤은 성공적인 분석에 나타납니다 어떻게 표시에 의해 생성된 Fluorogram가. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2829/2829fig4large.jpg">전체 크기 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>

<ol>
	<li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Takekawa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+detection+of+avian+influenza+virus+in+wild+birds:+evaluation+of+a+portable+rRT-PCR+system+and+freeze-dried+reagents.">Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents.</a> J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).</li><li>Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+internal+positive+control+for+rapid+diagnosis+of+avian+influenza+virus+infections+by+real-time+reverse+transcription-PCR+with+lyophilized+reagents.">Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents.</a> J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).</li><li>Spackman, E., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+virus+RNA+extraction+from+tissue+and+swab+material.">Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material.</a> Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).</li><li>Chen, R., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+inter-species+transmission+and+geographic+subdivision+in+avian+influenza+viruses+from+wild+birds.+Virology.">Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology.</a> , 383-3156 (2009).</li><li>Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+turnover+by+reassortment+of+replication+complex+genes+from+avian+influenza+A+virus.">Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus.</a> J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).</li><li>Dugan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+genetics+and+emergence+of+avian+influenza+viruses+in+wild+birds.">The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds.</a> PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).</li><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analyses+of+type+A+influenza+genes+in+natural+reservoir+species+in+North+America+reveals+genetic+variation.">Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation.</a> Virus Res. 114, 89-100 (2005).</li><li>Pasick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+based+techniques+for+the+diagnosis+and+characterization+of+avian+influenza+virus+infections..">Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections..</a> Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OIE+Manual+of+diagnostics+tests+and+vaccines+for+terrestrial+animals+(mammals,+birds+and+bees).">OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees).</a> 1, 258-269 (2004).</li><li>Weber, T. P., Stilianakis, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecologic+immunology+of+avian+influenza+(H5N1)+in+migratory+birds.">Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).</li><li>Kim, J. -. K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ducks:+the+"Trojan+Horses"+of+H5N1+influenza.">Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).</li><li>Gilbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flying+over+an+infected+landscape:+distribution+of+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+risk+in+South+Asia+and+satellite+tracking+of+wild+waterfowl.">Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl.</a> Ecohealth. , (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 빠른 진단 방법은 AIV의 감시에 대한 야생 조류 샘플 시간 효과적이고 정확하게 테스트를 용이하게합니다. 휴대용 RRT - PCR의 훨씬 덜 엄격한 표본 스토리지 요구 사항은 액체 질소 화주 또는 드라이 아이스를 사용할 수없는 경우 감기 체인의 유지 보수가 허무 수 있습니다 원격 상황에 적합합니다. 또한, 우리는 실험실 기반의 분자 분석의 최소한의 지식과 현장 생물학 자에 의해 수행?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> RNeasy 미니 스핀 칼럼 </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> 컬렉션 튜브 (1.5 &amp; 2 ML) </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> 버퍼 RLT </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> 버퍼 RW1 </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> 버퍼 RPE </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> RNase없는 물 </td><td> Qiagen </td><td> 74,106 </td><td> RNeasy 미니 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> 14.3 M β - 메르 캅 토 에탄올 솔루션 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP176100 </td><td></td></tr><tr><td> 100 % 에탄올 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> NC9602322 </td><td></td></tr><tr><td> 와동 지니 2, 120V </td><td> 과학 산업 </td><td> SI - 0236 </td><td></td></tr><tr><td> Taqman 인플루엔자 대상 1 (가수 분해 프로브) </td><td> 아이다호 기술 </td><td> ASAY - ASY - 0109 </td><td></td></tr><tr><td> Lightcycler 20ml 모세관 튜브 </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 04929292001 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ML 튜브에 대한 회전과 함께 마이크로 원심 분리기 </td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td> 빠른 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> Ruggedized 고급 병원체 식별 장치 (빠른) 7,200 </td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td> 빠른 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> Windows XP Professional과 펜티엄 기반의 노트북 </td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td> 빠른 키트에 포함된 </td></tr><tr><td> Lightcycler 데이터 분석 소프트웨어 </td><td> 아이다호 기술 </td><td></td><td> 빠른 키트에 포함된 </td></tr></tbody></table>

rapid diagnosis of avian influenza virus in wild birds: use of a portable rrt-pcr and freeze-dried reagents in the field

야생 조류는 철새 flyways 따라 감시를하라는, H5N1 subtype의 고도 병원성 조류 독감 (HPAI)의 확산에 연루되었습니다. 조류 독감 바이러스에 대한 야생 조류 (AIV)의 샘플링은 종종 원격 지역에서 실시하지만, 결과는 종종 있기 때문에 분자 테스트 갖춘 실험실에 샘플을 수송하기 위해 필요 지연됩니다. 실시간 역방향 transcriptase 효소의 연쇄 반응 (RRT - PCR)은 AIV의 진단을위한 가장 정확하고 민감한 방법 중 하나를 제공하는 분자 기법입니다. RRT - PCR에 필요한 이전에 엄격한 실험실 프로토콜 이제 필드에 적응하고 있습니다. 서부 유럽 표준시 시약의 수준에서 감도로, 감기에 사슬을 요구하지 않습니다 (동결 건조된) 동결 건조 시약의 개발은 현장에게 실질적인 목표에 원격 테스트를 가져왔습니다. 여기 우리는 동결 건조된 시약을 고용 RRT - PCR 장치 (Ruggedized 고급 병원체 식별 장치 또는 신속한, 아이다호 기술, 솔트 레이크 시티, UT) (인플루엔자 대상 1 Taqman를 사용하여 야생 조류의 AIV의 신속한 진단을위한 방법을 제시, ASAY을 - ASY - 0109, 아이다호 기술). 시약은 단일 튜브 적절한 농도에서 테스트에 필요한 모든 구성 요소를 포함 : primers, 프로브, 효소, 버퍼 내부 긍정적인 컨트롤, 부적 절한 보관 또는 서부 유럽 표준시 시약의 처리와 관련된 오류를 제거합니다. 휴대용 단위는 매트릭스 유전자 후 2-3 시간 후에 산출 결과를 대상으로 인플루엔자에 대한 화면을 수행합니다. 유전자 subtyping은 H5와 H7 프라이머와 함께도 가능합니다되는 대상에게 적혈구응집소 유전자를 설정합니다. 시스템은 철새 쇼어 버드 종의 자리에 시연 등 야생 조류에서 수집 cloacal와 oropharyngeal 샘플에 사용, 북부 캘리포니아에서 캡처한 서부 샌드피퍼 (Calidrus mauri). 적합합니다 동물 처리는 미국 지질 조사국 서양 생태 연구 센터와 연구소를 Banding 미국 지질 조사국 버드의 허가의 동물 케어 및 사용위원회의 승인 절차를 따랐다. 이 기술의 주요 장점은 원격 위치에 확산을 포함하는의 기회를 증가, 야생 조류의 진단을 신속하게하는 것입니다. 현장 진단은 또한 야생 인구에 감염된 개인을 식별하고 공부에 대한 유용합니다. 호스트 생물학 (감염 면역 및 생리 반응)과 공간적 생태 (감염된 조류의 철새 실적)에 대한 정보를 수집하는 기회는 야생 조류가 장거리 AIV에 대한 벡터 역할을 수있는 범위에 대한 통찰력을 제공할 것입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field at JoVE.com

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

이 연구는 휴대용 RRT - PCR 시스템을 사용 야생 조류에서 조류 독감의 진단을 설명합니다. 방법은 확산 시나리오의 전형이 아닌 실험실 환경에서 야생 조류를 화면에 냉동 건조 시약을 활용합니다. 분자 도구의 사용은 신속한 진단을 위해 정확하고 민감한 대안을 제공합니다.

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

rapid-diagnosis-avian-influenza-virus-wild-birds-use-portable-rrt-pcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K 조회수.  USGS Western Ecological Research Center. 이 연구는 휴대용 RRT - PCR 시스템을 사용 야생 조류에서 조류 독감의 진단을 설명합니다. 방법은 확산 시나리오의 전형이 아닌 실험실 환경에서 야생 조류를 화면에 냉동 건조 시약을 활용합니다. 분자 도구의 사용은 신속한 진단을 위해 정확하고 민감한 대안을 제공합니다.

비디오: Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

연구

면역학 및 감염병학

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

전자 레인지 전송 전자 현미경으로 식물 바이러스 질병의 신속한 진단을 도와

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.