,이 작품은 스코틀랜드 기금위원회 (부여 번호 HR07005에 의해 부분적으로 지원되었다 <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> , 의료 연구 스코틀랜드 () <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), 암 연구 영국의 실험 의학 암 센터 ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ), 그리고 혁신적인 유방암 ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. 조직 준비 <ol class="lalpha"><li> Microtomy <ol class="lroman"><li> 제 포르말린 고정 파라핀은 로터리 마이크로톰를 사용하여 4 μm의 두께에 종양 블록을 내장. </li><li> 적극적으로 청구 현미경 슬라이드에 섹션을 놓습니다. </li><li> 37 ° C 오븐 새벽에 슬라이드를 품어. </li></ol></li><li> 저장 <ol><li> -18에 저장 섹션 ° C -25 ° C에 냉동고, 항원성의 손실을 방지하기 위해서. </li></ol></li></ol> 2. 조직 섹션의 Immunofluorescence <ol class="lalpha"><li> Dewaxing 및 Rehydration <ol class="lroman"><li> Dewax 5 분 두번 크실렌에서 슬라이드. </li><li> 99 % 99 % 80 %, 에탄올 50 %와 순서로 각 2 분 수돗물을 실행에 슬라이드를 Rehydrate. </li></ol></li><li> 항원 불러오기 <ol class="lroman"><li> MI 5 분 압력 밥솥에서 0.15 MM 나트륨 구연산, 산도 6.0 버퍼를 사용하여 열을 유발 항원 검색을 수행crowave. </li><li> 20 분에 대한 슬라이드를 시원한 시간을 보내세요. </li><li> 로커에서 5 분 0.05 %의 PBST에서 슬라이드를 씻어. </li></ol></li><li> 절차를 차단 <ol class="lroman"><li> 10 분 3 %의 과산화수소에 섹션을 처리합니다. </li><li> 로커에서 5 분 0.05 %의 PBST에서 슬라이드를 씻어. </li><li> Sequenza의 Immunostaining 걸이에 섹션을 추가합니다. </li><li> 10 분에 대한 혈청 단백질 무료로 블록에서 섹션을 처리합니다. </li></ol></li><li> 차 항체 인큐베이션 <ol class="lroman"><li> 부화 차 항체는 실온에서 1 시간 Dako의 항체 희석액에 최적의 희석에 희석. </li><li> 5 분마다 세 번 PBST 0.05 %로 린스. </li></ol></li><li> 상피 마스크 (Cytokeratin) 인큐베이션 <ol class="lroman"><li> 4 박 Dako의 항체 희석액에 1시 50분을 희석 부화 마우스 안티 팬 cytokeratin, ° C. </li></ol></li><li> 상피 마스크 시각화 <ol class="lroman"><li> 염소 방지 마우스 Alexa555 s의 1시 25분 희석 준비미리 희석에 econdary 항체 염소 - 토끼 HRP 항체 솔루션을 구상. 상온에서 1.5 시간 동안 짙은 어둠 속에서 슬라이드를 품어. </li><li> 5 분마다 세 번 PBST 0.05 %로 린스. </li></ol></li><li> 대상 시각화 <ol class="lroman"><li> Sequenza에서 습도 챔버에 슬라이드를 전송합니다. </li><li> 1시 50분 농도에서 대상 신호 증폭 희석제 (HistoRx 욕조 E)와 Cy5 Tyramide을 (HistoRx 튜브 F) 결합합니다. 철저하게 섞어 소용돌이. 상온에서 10 분 동안 짙은 어둠 속에서 슬라이드를 품어. </li><li> 5 분마다 세 번 PBST 0.05 %로 린스. </li><li> 1 분 80 %의 에탄올에 슬라이드를 탈수. </li><li> 어둠 속에서 공기가 건조 슬라이드. </li></ol></li><li> Counterstaining 및 coverslipping <ol class="lroman"><li> coverslips에 DAPI 장착 매체를 적용하고 조직 섹션을 통해 coverslips 넣습니다. </li><li> 어둠 속에서 하룻밤 건조 슬라이드. </li><li> 슬라이드는 실내에 매니큐어와 보안 건조 후반드시 장기 보존 및 4 ° C의 냉장고에 보관. </li></ol></li></ol> 3. 전체 섹션 검색을 사용하여 이미지 캡처 <ol class="lalpha"><li> Aperio ScanScope FL 슬라이드 스캐너의 슬라이드 카세트에서 다섯 슬라이드까지로드합니다. </li><li> 각 슬라이드 들어, ScanScope 콘솔의 인터페이스를 사용하여 이미지를 일반적인 영역을 선택합니다. 에 관계없이 패턴이나 샘플의 다른 측면을 관찰할 수 염색법의 슬라이드에있는 모든 조직을 포괄하는 지역을 선택합니다. </li><li> 각 채널 (DAPI, Cy3과 Cy5) 다음과 같은 최적의 노출을 결정을 위해, ScanScope 콘솔을 사용 : <ol class="lroman"><li> 심문하기 위해 조직의 영역을 선택 -이 영역은 이상, 최고의 표현을 제공하는 조직의 종양이 지역에 있어야합니다. </li><li> ScanScope 콘솔 autoexposure 기능을 사용하여 이미지 초점과 함께, 각 채널에 대한 제안 노출 시간을 평가합니다. </li><li> 공동 각 샘플의 3-5 지역까지 이상 반복가치의 안정성을 nfirm. </li></ol></li><li> 플랫 필드 보정 이미지가 각각의 필터에 대한 취득한 것입 배경 영역을 정의하려면 여전히 슬라이드의 coverslipped 지역 내에서 아직 멀리 조직에서 추가 지역 (로 ScanScope 콘솔 이미지에 블루 다이아몬드로 표시)를 선택합니다. </li><li> 이전 이미지 수집 이러한 이미지를 검토합니다. 이미지가 높은 배경이나 다른 이미지 유물을 보인다면, 이미지 지역은 이동과 새로운 이미지를 취득해야합니다. </li><li> 획득 디지털 슬라이드 이미지는 Aperio 스펙트럼 데이터베이스에 자동으로 업로드됩니다. </li></ol> 4. 아쿠아 자동 이미지 분석 <ol class="lalpha"><li> 스펙트럼 데이터베이스에 디지털 전체 슬라이드 이미지를보기 및 전체 조직 및 얼룩 패턴 (들)의 맥락에서 관심 종양 영역을 주석. </li><li> 두 엄지손가락을 클릭하여 스펙트럼 데이터베이스에 디지털 슬라이드 목록에서 AQUAnalysis를 사용하여 분석할 수있는 슬라이드를 선택손톱 이미지 (또는 이미지 옆의 체크 박스를 선택하고 선택한 다음 목록의 상단에있는 메뉴에서 &#39;이미지보기&#39;). 이것은 자동으로 ImageScope 소프트웨어와 조직 샘플의 색상 병합된 이미지를 엽니다. </li><li> 제공된 도구를 사용하여 이미지를 탐색할 수이 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 동반 H &amp; E을 (실제 슬라이드 또는 주석 이미지)를 사용하여 형광 이미지의 관심 영역을 주석. 관심의 여러 지역, 개인, 지역 동그라미 하나의 샘플에서 선택할 수 있습니다. 선택한 지역 내의 지역 (예 : 손상된 조직, 가난한 조직학의 영역이 아닌 종양 분야, 이물질 등) 제외하는 데 사용되는 &#39;부정적인&#39;도구도 있습니다. </li><li> 이미지에 주석 레이어 (들)을 저장합니다. </li><li> 스펙트럼 메인 메뉴로 돌아가기하고 주석했던 이미지 옆에있는 확인란을 선택합니다. 목록의 맨 위에있는 메뉴 스트립에서 &#39;분석&#39;을 선택합니다. </li><li> 분석 창에서있는가 sele을 것이다풀다운 메뉴에서 중부 표준시 &quot;HistoRx 아쿠아 분석&quot;. </li><li> 주석의 여러 레이어가있는 경우, 분석을위한 적절한 레이어 (들)을 선택하십시오 확인란을 사용합니다. </li><li> &#39;분석&#39;버튼을 언제 시작할 준비를 누르십시오. </li><li> 이 시점에서, 최소화된 콘솔 창이 Windows 작업 표시줄에 나타납니다. 이것은 스펙트럼 데이터베이스에서 로컬 PC ( &#39;당겨&#39;작업)에 이미지의 전송의 진행 상황을 표시합니다. </li><li> 데이터가 전송되면 AQUAnalysis가 시작됩니다. 사용자는 이미지를 볼 탐색 및 분석하는 소프트웨어의 내부의 모든 기능을 사용할 수 있습니다. </li><li> 스펙트럼 데이터베이스에서 이미지의 주석이 지역은 512x512 픽셀의 이미지 타일로 깨진입니다 - 개별적으로 채점한다 각. </li><li> 이 연구에 대한 데이터 클러스터링을 기반으로 혼자 가잖아 아쿠아 점수 알고리즘은, 8 사용되었다. 이 알고리즘에서는 아쿠아 점수는 다음과 같이 생성됩니다 : <ol class="lroman"><li> 팬 - cytokeratin 이미지시gnal은 배경 위에 thresholded 있으며, 이러한 픽셀은 다음 후속 계산에 사용되는 종양 &#39;마스크&#39;를 정의하는 데 사용됩니다. 높은 표현 팬 - cytokeratin 픽셀은 또한 종양 세포의 세포질 / 비 핵 영역을 정의합니다. </li><li> 종양 마스크 내에있는 DAPI 채널에서 높은 신호 픽셀은 자연의 핵으로 식별됩니다. </li><li> 클러스터링 알고리즘은 DAPI의 얼룩이나 cytokeratin 표현과 부분적으로 핵이나 세포질 구획, 또는 배경 중 하나에 그들을 속성하려고 시도하거나 낮은 강도를 가지고 픽셀을 검사합니다. </li><li> 일단 모든 화소가 종양 구획이나 배경 중 하나, 대상 단백질 (ER 또는 HER2)에서 신호의 강도에 할당된 그때 따라서 아쿠아 점수를 생산, 구획의 각과 구획의 크기에 표준 시간 계산됩니다. </li><li> 충분한 종양 표현이 없었 이미지는 (같은 르있는 사람에 의해 정의된 점수되지 않았습니다SS 종양을 나타내는 픽셀의 5 % 이상). 이 지역은 &#39;실패&#39;라는 &#39;최종 결과&#39;가치를 생산하기 때문에 후속 통계 분석에서 제거할 수 있습니다. </li><li> 또한 검토한 경우, 운영자가 샘플이나 이미지 아티팩트 (예 : 접힌 조직, 이물질)에 의해 채점에 적합되지 않은 필드를 확인, 해당 필드는 채점에서 수정된와 &#39;최종 결과&#39;, &#39;실패&#39;라는 생산되었다. </li></ol></li><li> 아쿠아 점수의 결과는 전체 조직 섹션 샘플 내에서 관심 영역의 각 512x512 픽셀 타일과 관련된 점수의 테이블입니다. 이러한 파일은. CSV 형식으로 다음 후속 통계 분석을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 5. 통계 분석 : 모든 통계 분석은 SPSS에서 수행하는 (IBM) <ol><li> 가능하다면은, 큰 작업에, 데이터 조작 및 분석 단계를 수행하기 위해 SPSS 구문 코드 파일 (. SPS)를 생성합니다. 예제 구문 코드는 보충 파일로 제공됩니다. </li><li&gt;는 SPSS에 데이터 파일을 읽어 보시기 바랍니다. 원시 데이터 (예 : 악기 특정 매개 변수가 아닌 활용 구획에서 아쿠아 점수)에서 사용하지 않는 변수를 제거합니다. </li><li> 지역이 &#39;실패&#39;의 &#39;최종 결과&#39;를 (위 참조)가 어디에, 수치 분석에서 그들을 제거 SYSMIS, 이러한 값을 표시합니다. </li><li> 집계 SPSS 형식으로 설정된 하나의 마스터 데이터로 각 마커 (ER 또는 HER2)에 대한 모든 슬라이드에 대한 모든 데이터입니다. 이후의 모든 계산이 마스터 파일을 사용합니다. </li><li> ER 또는 HER2 (부가 구문 파일을 참조) 데이터가 추가로 확인하고 다양성 심슨의 인덱스가 다음과 같이 계산 : SPSS 구문 파일 (각 마커에 대해 하나를 사용하여 <ol class="lroman"><li> 마스터 데이터 이전에 생성한 일련의 수정을 방지하기 위해, 마스터 분석 파일을 생성합니다. </li><li> 생성된 원시 데이터 및 이미지에 대한 설정 마스터 데이터를 확인합니다. </li><li> 각 샘플에 대한 아쿠아 점수 (분야의 개수에 대한 요약 통계를 생성 점수, 평균 점수, minimu을 의미m 점수, 최대 점수, 그리고 샘플에 대한 점수의 표준 편차). </li><li> 원래 원시 데이터를 출력 파일에 대한 점수와 RAW 이미지 데이터에 대한 결과의 무작위 표본을 확인합니다. </li></ol></li><li> 열지도 이미지 (그림 2, 3 참조) 생성하려면 : <ol class="lroman"><li> 여덟 개인 레벨로 &#39;빈&#39;아쿠아 점수 데이터 (SPSS에서 &#39;비주얼 Binning&#39;기능을 사용하여). ER 들어, 핵 점수는 HER2에 대한, 세포질 점수를 사용했고 사용되었습니다. </li><li> 각 방식은 전체 데이터 세트에서 제공 가지 경우 동일한 비율을 나타내는 것과 같은 방식을 도출. </li><li> 모든 후속 출력이 &#39;당 슬라이드 / 샘플&#39;수준에 될 수 있도록 SPSS 기능을 &#39;분할 파일&#39;을 사용합니다. </li><li> 그것이 할당된되었던에 빈에 해당하는 가치는 X, Y 좌표 및 색상 (그림 2 및 3 참조) 각 지역 (512x512 타일에 해당)를 플롯. </li></ol></li><li> 이질 점수를 생성하려면, 코드는 심슨의를 생성하도록 작성되었다아쿠아 점수를 사용하여 다양성 지수. <ol class="lroman"><li> 여기에 사용되는 다양성의 심슨의 인덱스는,로 정의됩니다 : <img alt="등식 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" /> N은 주어진 샘플에 사용되며 n은 표준 점수 (아래 설명된대로 생산)의 주어진 그룹에 점수 / 필드의 번호입니다 점수 / 필드의 총 개수입니다. </li></ol></li><li> 마스터 분석 파일이 데이터 원본에 대한 위에서 설명한 사용합니다. 표시된 예제에서, 모든 ER 계산은 핵 아쿠아 점수와 세포질 아쿠아 점수를 사용하여 계산 HER2를 사용합니다. 각 샘플 / 슬라이드 아래의 계산을 수행합니다. </li><li> 형광 데이터가 분산 불안정에 따라 달라질 수 있기 때문에, 그러한 그 오류 진도는 진도와 전파, 모든 아쿠아 점수에 로그 (기본 2) 정상화를 적용합니다. </li><li> 또한 표준 (로그 변환) 데이터는 Z - (표준) 점수로 변환. <ol class="lroman"><li> Z - 점수 변환은 계산합니다의 다음과 : Z = (아쿠아 점수 - 예제에 대한 모든 점수의 평균) / 샘플에 대한 점수의 표준 편차. 이것은 제로 편차의 중심 가치를 주위에 편차의 분포로 점수의 분포를 변환합니다. </li></ol></li><li> 빈 이러한 Z - 점수 값 여섯 그룹 (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0-1, 1-2&gt; 2)로. </li><li> 각 방식에 대한 각각의 휴지통 및 합계에 할당된 값의 개수를 계산합니다. 색인에 ​​사용되는 여섯 방식 각각에 대한 값을 계산하기 위해, 필드의 총 개수와 함께,이 값을 사용합니다. </li><li> 이러한 값을 합계 다양성의 색인을 생성하기 위해 하나 뺍니다. </li><li> 다양성 지수는 특정 샘플에 대한 평균 점수 주위의 확산의 지표를 제공합니다. 따라서, 높은 지수는 점수의 광범위한 확산, 또는 표현의 이질 증가를 나타냅니다. 반대로, 낮은 인덱스는 표현 측정에 적은 변화와 샘플 균질 표현을 나타냅니다. 이 Figur에 삽화가이다초밖에 2 3. </li></ol> 6. 대표 결과 : 같은 tamoxifen과 trastuzumab과 같은 상대적으로 낮은 독성 대리인,와 타겟 치료는 난소 암 환자에 대한 치료의 표준되지 않습니다. 백금 - taxane 첫 선 화학 요법은 난소암 9-13 다른 화학 요법의 regimens에 우수하고, 환자의 70-80%는 초기 응답 대부분의 재발되며, 자신의 질병 죽는 동안 좋은 증거가있다. 대체 치료에 대한 응답을 예측할 수 생체 측정은 각 환자에 대한 개별적인 치료를 선택에 도움이 될, 그리고 종양에 대한 화학 요법 미치는 선택 압력 때문에, 살아남은 종양 세포는 다른 특성을 가지고 있으며 치료 전에 종양의 subpopulation을 나타내는 수 있으며, 이것을 quantifying 변화는 따라서 유용할 수 있습니다. 우리는 orde에 화학 요법 전후의 난소 암 표본의 응급실과 HER2 표현하기 위해 이질 매핑 방식을 적용R은 표현의 양적 변화를 측정하고 치료 전후 biomarker 표현 사이의 관계를 평가합니다. ER과 HER2 모두 개별 종양 내에 표시된 이질을 설명하고, 일부 종양에서 낮은 이질 상대적으로 높은 이질의 치료 후 심슨의 인덱스 변경, 심슨의 색인 점수를 (그림 2 및 3 참조) 감소로 표시. 이것은 clonal 선택 세포 독성 화학 요법에 대한 응답으로 발생하는 개념을 지원, 더 중요한 것은, 이것은 더 나은 암 환자에 대한 치료를 개인을 위해, 잔류 인구에 대한 타겟 치료를 사용하여 악용될 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" /> 변수 형태를 보여주는 같은 난소암의 여러 영역 그림 1. Hematoxylin 및 eosin 얼룩 photomicrographs. (A) x40 현미경은 형태 변화와 종양의 두 인접한 영역을 보여줍니다. 고전력보기 (x20조직의 하단 부분 (C)이 더 균질의 호산 구성 세포질과 젖꼭지 성장 패턴을 가지고 반면 0), 세포질 지우고 종양의 위쪽 부분 (B) 성장의 솔리드 패턴으로 세포를 공개. 이 종양은, 그러나, 더 이상 관리의 목적을 위해 묽은 젖꼭지 histological subtype으로 분류됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" /> 그림 2. cytokeratin 양성 난소 암 조직에서 ER 단백질 표현의 이질의 heatmaps 전 (위쪽 패널) 및 (하단 패널) 치료 후. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" /> 그림 3. HER2 단백질 cytokeratin - 양성 난소 암 조직에서 표현, 전 (위쪽 패널)과 후 (아래 패널) 치료의 이질의 heatmaps.

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	<li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. 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J., Li, X., Landis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features.">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).</li><li>Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+changes+in+ER,+PR+and+HER2+expression+in+primary+breast+cancer+and+paired+nodal+metastases.">Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases.</a> Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).</li><li>Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis.">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li></ol>

JC, MG, CJ, 그리고 CS가 HistoRx, Inc의 직원 아르

방법은 여기에 종양 물질의 표준 포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 histologic 섹션에 분자 이질의 허가를 부량을 설명했다. 방법은 이것이 다음 biomarker 개발과 분석 변수로 고려 수 있도록 조직 섹션에 이질의 정도에 할당할 값을 수 있습니다. 일반적으로 그것이 조직의 생체는 분석이 샘플링 오류 또는 바이어스 적은 쉽습니다 있도록 표현과 관련하여 균질되는 것이 바람직하지만, 그것은 어떤 상황에서 매개 변수로 이질을 계량하는 것이 유용 하리라 생각됩니다. 예를 들어, 같은 ER과 HER2에 대한 설명의 예제와 같이, 일반적인 생체은 표현의 상당한 이질을 표시하고이 임상 결과를 또는 치료에 대한 응답에 대하여 독립적인 전조 또는 예측 요소 각각을 대표하는 여부를 현재 알 수있다. 마찬가지로, 그림과 같이, 치료 자체가 동적을 변경 수대상 농축의 구성 세포의 인구, 따라서 측정은 치료 결정을 유도에 유용하게 사용될 수 있습니다. 그러나, 기술은 전통적인 (예 : immunohistochemical 등) histopathological 또는 biomarker 분석을 제한 같은 요인에 의해 제한됩니다. 결과 유형, 크기 및 분석되는 조직의 품질, 따라서 하나의 조직 섹션에 의존하면 전체 종양의 대표되지 않을 수 있습니다. 사실, 심슨의 인덱스는 신체 조직의 크기 (캡처 및 아쿠아 점수가 측정 프레임 번호)에 의해 편향된 수 있습니다. 측정되는 epitopes의 immunogenicity는 artifactually 조직 부분 (예 : 감기 국소 빈혈 시간, 또는 고정 길이, 그리고 가장자리 유물 등)에 걸쳐 자신의 표현을 변경 지나치게 사전 분석 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 이것은 특히 악명 불안 정한 14, 15아르 phospho - epitopes에 대한 문제입니다. 따라서 기술은 더 적합 수도 있습니다절제술의 표본보다는 작은 biopsies하고, 오히려 하나 이상의 여러 섹션에서 수행. 궁극적으로, 3D 영상 기술은 더이 매개 변수를 정할 수있는 기회를 제공할 수 있습니다. 로 제시 기술은 또한 cytokeratin 마스킹 에피토프 표현의 다양성 등 생물 학적 요인에 의해 제한될 수 있습니다. 이것은 난소와 상피 - 투 - mesenchymal 전환 (EMT)을 받아야하거나 비 상피 구성 요소 또는 줄기 세포 16 풍부 아르 유방암을 포함하여, 그 암 특히 우려로 최근에 발생하는 표시되었습니다 수도 화학 요법 - 체외 17과 치료 18에 대한 응답으로 유방암 환자의 난소 암 치료. 이 제한은 이러한 구급대 16 upregulated 있습니다 cytokeratin 플러스 vimentin로 대체 마스킹 항체 (또는 항체의 칵테일)를 사용하여 극복할 수 있습니다. 또한, 조직의 다른 부품 (마이크 이후이러한 섬유아 세포 또는 혈관 내피 세포로 roenvironment)가도 점점 생물 학적 치료의 대상이되고, 기술은 또한 혈관 내피 세포 얼룩 이러한 PECAM / CD31와 같은 관심의 구획에 대한 구체적인 마스크를 사용하여 이러한 구성 요소를 점수로 확대 수 있습니다 . 심슨의 색인의 적응이 간단하기 때문에 현재의 프로토콜 이질의 척도로 사용되고 있지만, 이질의 다른 조치 (분산, 평균 등 평균) 등 중앙 경향의 간단한 측정으로 사용할 수 있습니다. 또한, 심슨의 인덱스 계산은 더 특정 테스트 인구에 맞게 수정할 수 있습니다. Z - 점수 변환의 사용은 이질이 데이터 집합에 대한 평균 주위 편차에 기반이기 때문에 채점 여러 마커에 대한 더 적용할 수 있습니다. 그러나, 점수의 전체 범위는 변환이 유형 제한될 수 있습니다. 일부 디자인은 더 나은 적합있을 수 있습니다단순히 특정 마커 세트의 모든 샘플에 대한 실제 아쿠아 점수를 빈 수 있습니다. 방식과 cutoffs의 수를 선택도 발생할 수 있습니다 값의 범위에서 제한하고 대체 실험 디자인에 최적화된 수 있습니다. 우리는 그들이 이미 병원에서 사용되기 때문에, 후보 생체로 현재의 연구에 응급실 및 HER2를 사용하여 타겟 요법의 효능과 관련하여 관련 임상 문제에 대한 해답을 얻을 수 있도록하고, 상당한 이질 변화를 전시한다고 알려져 있습니다이 기본 및 먼 19 질병. 그러나, 이질 최적의 마커가 결정 남아 있습니다. 다른 가능성은 이전에 계면 생선 연구 20에서 사용되는 것과 clonality의 cytogenetic 마커를 포함할 수 있습니다. 접근 방식은 더 이상 암 생물학이 매개 변수의 관련성을 확립하기 위해 크고 잘 주석 임상 동료 또는 임상 실험에서 추가 유효성 검사를 필요로합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> 사용으로 공급 업체의 시설 </td></tr><tr><td> 스펙트럼 </td><td> Aperio </td><td> 스펙트럼 </td><td> 구성 및 카탈로그 번호는 지역 기관들이 데이터베이스 및 IT 구조를 설정하는 방법에 따라 달라질 수 있습니다. </td></tr><tr><td> AQUAjustment와 함께 AQUAnalysis, </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> AQUAjustment 패키지 AQUAnalysis이 스펙트럼에 저장된 이미지를 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 400 희석 1 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 팬 cytokeratin </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 50 희석 1 </td></tr><tr><td> 항체 희석액 </td><td> Dako </TD&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 - 토끼 HRP를 구상 </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> 단백질 블록 </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 안티 마우스 Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI 장착 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 Tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ - EMR1 - 00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza의 Immunostaining 센터 </td><td> 써모 과학 Shandon </td><td> 73300001 </td><td> 벤치 - 최고 immunofluorescence의 얼룩 여기 사용 </td></tr></tbody></table>

heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence

개별 종양 내에 Morphologic 이질은 외과 연습의 histopathologists에 의해 잘 인식됩니다. 이것은 종종 인식 histological subtypes에 뚜렷한 분화 영역의 형태로, 또는 다른 병리 학적 등급을 소요하는 동안 종종 정확한 분류 (그림 1)을 무시 표현형 더 미묘한 차이가있다. 형태가 기본 분자 표현형에 의해 결정되기 때문에 궁극적으로, 눈에 보이는 차이와 지역은 휴대 전화 기능과 동작을 조정 단백질의 표현의 차이, 따라서, 외모 동반 될 가능성이 높습니다. 예후에 대한 가시 성과 보이지 않는 (분자) 이질의 의미는 알 수 있지만, 최근의 증거는 적어도 유전자 수준에서 이질은 기본 종양의 1,2에 존재하며, 이러한 하위 클론의 일부가 전이성을 일으키다,하는 것이 좋습니다 ( 따라서 치명적인) 병. 또한, 일부 단백질은그들은 치료의 목표 (tamoxifen과 trastuzumab (Herceptin)에 대한 인스턴스 ER과 HER2, 각각에 대해) 때문에 생체로 측정. 이 단백질은 종양 내에서 변수 표현을 보여주면 치료 반응도 변수가있을 수 있습니다. immunohistochemistry을 위해 널리 사용되는 histopathologic 점수 제도도 무시, 또는 숫자 단백질 표현의 부량을 homogenize. 마찬가지로, 종양 샘플 (예 : 유전자 발현 프로 파일링 등) 균질 아르 파괴적인 기술에, 양적 정보 elucidated 수 있지만 공간 정보가 손실됩니다. 췌장암의 유전자 이질 매핑 접근 방식은 단일 세포 현탁액 3 세대에 의존하거나, 또는 macrodissection 4에있다. 최근 연구는 형태학 및 분자 매핑이 가능합니다 그 원리의 증거를 제공하고, 전립선 암 조직 5 morphologic와 분자 이질을지도하기 위해 양자 도트를 사용하지만, s를 떨어지고있다이질을 quantifying의 hort. immunohistochemistry이 있기 때문에, 최고만이 세미 양적 및 내부 및 간 관찰자 바이어스, 더 민감하고 정량 방법에 따라 정확하게 현장에서 조직 이질을지도와 수치하기 위해 필요합니다. 우리는 체계적으로 자동 정량 분석 (아쿠아) 시스템을 기반으로 6 종양 전체 조직 섹션에 단백질 표현의 이질을 계량하기 위해 개발하고 실험 및 통계 방법을 적용했습니다. 조직 섹션은 형광단 - 레이블 차 항체에 결합 cytokeratins와 관심 대상에 대한 감독 특정 항체와 표시하고 있습니다. 슬라이드는 슬라이드 전체를 형광 스캐너를 사용하여 몇 군데 있습니다. 이미지는 타일 수천 수백으로 세분화하고, 각 타일은 다음 조직의 상피 (종양) 구성 요소 내의 단백질 농도 측정하기위한 한 방법입니다 아쿠아 점수를 할당됩니다. Heatmaps은 심슨의 생물 다양성 지수 7을 기반으로 원래 생태학에서 사용되는 이질의 통계 측정을 사용하여, 단백질 및 할당 이질 점수의 조직 표현을 나타내기 위해 생성됩니다. 현재까지 histological 준비에 체계적으로 단백질 표정으로 나란히이 다양​​성을지도와 수치 아무런 시도를 한번도 가본 적이있다. 여기서 우리는 ER과 난소암에서 HER2 biomarker의 표현에 적용 방법의 첫 번째 사용을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 예후와 치료에 대한 반응의 예측에 이질의 중요성을 확립하기 위해, translational 연구 biomarker의 표현의 연구에서 독립 변수로 이질을 분석하는 방법을 불법 체류자.

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Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

여기 수량 immunofluorescence, 이미지 분석, 이질의 통계 측정을 사용하여 종양이 자료 histological 섹션에 분자 이질을 계량하는 방법을 설명합니다. 방법은 임상 biomarker 개발 및 분석에 사용하기위한 것입니다.

양적 Immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

heterogeneity-mapping-protein-expression-tumors-using-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

18.5K 조회수.  University of Edinburgh. 여기 수량 immunofluorescence, 이미지 분석, 이질의 통계 측정을 사용하여 종양이 자료 histological 섹션에 분자 이질을 계량하는 방법을 설명합니다. 방법은 임상 biomarker 개발 및 분석에 사용하기위한 것입니다.

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

연구

의학

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

의 식별<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em링커로 인한 PCR을 사용하여 고체 종양의&gt; Transposon의 삽입

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

기본 마우스 대장 종양의 체외 Organoid의 문화

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

개인 신장 세포 암에서 단백질 표현 변화를 탐험하기 위해 역 위상 단백질 배열 (RPPA)의 사용

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Coordinate Mapping of Hyolaryngeal Mechanics in Swallowing

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement whereas coordinate mapping of hyolaryngeal mechanics using Modified Barium Swallow (MBS) uses one set of coordinates to calculate multiple variables of interest. For demonstration purposes, ten kinematic measurements were generated from one set of coordinates to determine differences in swallowing two different bolus types. Calculations of hyoid excursion against the vertebrae and mandible are correlated to determine the importance of axes of reference.
To demonstrate coordinate mapping methodology, 40 MBS studies were randomly selected from a dataset of healthy normal subjects with no known swallowing impairment. A 5 ml thin-liquid bolus and a 5 ml pudding swallows were measured from each subject. Nine coordinates, mapping the cranial base, mandible, vertebrae and elements of the hyolaryngeal complex, were recorded at the frames of minimum and maximum hyolaryngeal excursion. Coordinates were mathematically converted into ten variables of hyolaryngeal mechanics.
Inter-rater reliability was evaluated by Intraclass correlation coefficients (ICC). Two-tailed t-tests were used to evaluate differences in kinematics by bolus viscosity. Hyoid excursion measurements against different axes of reference were correlated. Inter-rater reliability among six raters for the 18 coordinates ranged from ICC = 0.90 - 0.97. A slate of ten kinematic measurements was compared by subject between the six raters. One outlier was rejected, and the mean of the remaining reliability scores was ICC = 0.91, 0.84 - 0.96, 95% CI. Two-tailed t-tests with Bonferroni corrections comparing ten kinematic variables (5 ml thin-liquid vs. 5 ml pudding swallows) showed statistically significant differences in hyoid excursion, superior laryngeal movement, and pharyngeal shortening (p &#60; 0.005). Pearson correlations of hyoid excursion measurements from two different axes of reference were: r = 0.62, r2 = 0.38, (thin-liquid); r = 0.52, r2 = 0.27, (pudding).
Obtaining landmark coordinates is a reliable method to generate multiple kinematic variables from video fluoroscopic images useful in dysphagia research.

Coordinate mapping is a method of documenting salient features of hyolaryngeal biomechanics in the pharyngeal phase of swallowing. This methodology uses image analysis software to record coordinates of anatomical landmarks. These coordinates are imported into an excel macro and translated into kinematic variables of interest useful in dysphagia research.

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of the fresh gas entering a lung region divided by the region&#8217;s end-expiratory volume &#8213; in the human lung, using only inhaled oxygen as a contrast agent. Regional quantification of specific ventilation has the potential to help identify areas of pathologic lung function. Oxygen in solution in tissue shortens the tissue&#8217;s longitudinal relaxation time (T1), and thus a change in tissue oxygenation can be detected as a change in T1-weighted signal with an inversion recovery acquired image. Following an abrupt change between two concentrations of inspired oxygen, the rate at which lung tissue within a voxel equilibrates to a new steady-state reflects the rate at which resident gas is being replaced by inhaled gas. This rate is determined by specific ventilation. To elicit this sudden change in oxygenation, subjects alternately breathe 20-breath blocks of air (21% oxygen) and 100% oxygen while in the MRI scanner. A stepwise change in inspired oxygen fraction is achieved through use of a custom three-dimensional (3D)-printed flow bypass system with a manual switch during a short end-expiratory breath hold. To detect the corresponding change in T1, a global inversion pulse followed by a single shot fast spin echo sequence was used to acquire two-dimensional T1-weighted images in a 1.5&#160;T MRI scanner, using an eight-element torso coil. Both single slice and multi-slice imaging are possible, with slightly different imaging parameters. Quantification of specific ventilation is achieved by correlating the time-course of signal intensity for each lung voxel with a library of simulated responses to the air/oxygen stimulus. SVI estimations of specific ventilation heterogeneity have been validated against multiple breath washout and proved to accurately determine the heterogeneity of the specific ventilation distribution.

Specific ventilation imaging is a functional magnetic resonance imaging technique that allows for quantification of regional specific ventilation in the human lung, using inhaled oxygen as a contrast agent. Here, we present a protocol to collect and analyze specific ventilation imaging data.

양성자 자기 공명 영상 및 조 영제로 산소를 사용 하 여 인간의 폐에 특정 통풍의 정량 매핑

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...