우리는 우수한 기술 지원과 물고기 보호를위한 V. Zimmermann 감사드립니다. 310000_120611 :이 작품은 스위스 국립 과학 재단, 기금 번호에 의해 지원되었다.

1. 장비 설정 <ol><li> cryoinjury을 수행하는 데 사용되는 주요 도구는 저온 탐침, 스테인리스 스틸 (그림 1A)으로되어 펜 같은 악기이다. 원통형 손잡이 길이 40mm이다와 8 mm의 직경을 가지고 있습니다. 작은 주걱의 끝부분은 6 mm 길이와 직경 0.8 mm입니다. 팁과 핸들 사이의 접합은 길이 4mm 원추형이다. 또한, 저온 탐침의 핸들이 절차를 수행하는 동안 도구를 누른 상태에서 손가락 동상을 방지하기 위해 플라스틱 튜브 및 테이프와 격리되어야한다. </li><li> cryosurgery에 필요한 기타 자료 stereomicroscope, 날카로운 포셉, 마이크로 해부 봄 가위와 플라스틱 전송 피펫입니다. 또한 물고기를 전송하는 생선과 플라스틱 숟가락을 anesthetizing위한 비커를 준비합니다. </li><li> 수술하는 동안 생선의 복부 측면까지 (그림 1B)와 젖은 스폰지에 표시됩니다. , 안정 프로 시저에서 동물을 잡아주세요적절한 그루브 수동 스펀지에서 절단한다. </li><li> 수술 후 물고기를 전송하는 시스템 물로 수조를 준비합니다. </li><li> 십초 카운트 후 자동 24초 카운트 처음에 더블 타이머를 설정합니다. </li></ol> 2. Cryoinjury 절차 <ol><li> 최소 3 분 동안 액체 질소 3-5cm의 팁을 immersing하여 저온 탐침을 시원한 시간을 보내세요. </li><li> 물고기가 다시 켜지과 아가미 거의 (약 90 초) 이동 멈출 때까지 0.02 % tricaine에 immerging하여 성인 zebrafish를 마취. </li><li> (그림 1B) 거꾸로 물고기를 잡고 절단되어 촉촉한 스펀지로 플라스틱 스푼으로 물고기를 전송합니다. 비 지배적인 손을 사용 포셉를 흔들지 물고기를 잡아. 시각 심장의 후부 중간 마진을 찾아서 주사 피부를 곧바로 iridectomy 가위를 사용합니다. (그림 1C). </li><li> 세제곱하여 가슴 위에 작은 (약 2mm) 절개 만들기피부, 근육 (그림 1D)를 통해 직선 anteriorly tting. 이것은 동물을 죽이지하므로 골질 아가미의기구를 통해 끄지 마. </li><li> 부드럽게 박동 뇌실에 직접 액세스할 수 있도록 허용하려면 가위 끝으로 hypodermis의 은빛 상피 층 (그림 1E)를 찢어. 이러한 의사에 찔린 마음으로 뱃속에 깊이 가위를 삽입하지 마십시오. 고동 치는 심장이 잘 볼 수 있어야하고, 더 광범위한 출혈 thoracotomy (그림 1 층) 동안 발생해서는 안됩니다. </li><li> 24초 다음 10 초 동안 설정된 프로그램의 타이머를 시작합니다. 십초 동안 액체 질소의 저온 탐침을 파괴한다. 부드럽게 흔들어하여 저온 탐침에 대한 더 이상의 질소가 없는지 확인합니다. laterally 가슴 (그림 1 층)을 엽니다 집게를 사용하여 절개를 펴. </li><li> 타이머가 울리면 10 초 후 PR의 일각 즉시지만 부드럽게 뇌실 만지지전자 냉각 저온 탐침 (그림 1G). </li><li> 타이머 고리 24초되면 조직에서 저온 탐침을 공개하는 가슴에 플라스틱 피펫을 사용하여 시스템 물로부터 2-3 ML을 부어 및 시스템 물로 수조에 물고기를 전송합니다. </li><li> 물고기는 몇 초 후 호흡을 다시 시작하고, 그러면서 그것은 수영을 재개해야합니다. 그것이 45 주변에 초 후 숨을하지 않는 경우, 그것 자체가 호흡을 시작할 때까지 플라스틱 피펫으로 아가미로 물을 squirting하여 동물을 자극. 우리의 경험에서, 물고기의 95 %는 수술을 생존, 모든 죽음은 수술 당일 발생합니다. 그것은 incisions을 치료 필요 없습니다. </li></ol> 3. 심장 수집 및 고정 <ol><li> 심장, 두 포셉, 마이크로 해부 가위와 촉촉한 홈 붙이 스펀지를 해결하기위한 microcentrifuge 튜브에 포르말린 2 % 한 ML을 준비합니다. </li><li> cryoinjury 후 선택 일 때, 5 분 0.1 % tricaine에서 물고기를 안락사. </li><li> 를 삽입최대 습한, 그거 나올 스펀지로 물고기 복부 쪽. 마이크로 해부 가위로 아가미의 연골을 통해 심장 위에 큰 (약 4mm) 절개를합니다. 포셉 (그림 1H)로 광범위하게 절개를 엽니다. </li><li> bulbus arteriosus, 뇌실 (그림 1 HI)에 앞부분은 흰색 구조를 꼬집어, 그리고 그것을 당기는하여 캐비티로부터 심장을 제거합니다. 전체 해부하는 마음은 그림 1J과 그림 2A에 표시됩니다. </li><li> 2퍼센트 포르말린 1 ML로 microcentrifuge 튜브에 3의 마음까지 넣습니다. 부드럽게 튜브를 여러 번 돌려 4 시에 그것이 하룻밤 사이에 유지 ° C. </li></ol> 4. 심장은 마운트 <ol><li> 5 분간 PBS의 마음을 씻어. 4 ° C에서 미리 냉각되어야 30 % 자당의 10 ML에 마음을 전송하고, 부드럽게 섞는다. 표본은 초기 자당 용액의 표면에 부유한다. 4 ° C.에 1 시간 20 분 동안 배양을 계속 후이번에는, 마음은 튜브의 바닥에 가라앉을 것이다. </li><li> 드라이 아이스와 상자를 준비합니다. 퍼가기 주형을 가지고, 금형의 하단에 10월 장착 매체의 5 밀리미터 레이어를 붓는다. </li><li> 포셉는 금형에 매체를 장착 OC T로 마음을 장소. stereomicroscope 아래에서 위로 향해 금형의 하단에있는 심실 꼭대기, 그리고 bulbus arteriosus를 달성하기위한 표본의 방향을 조정합니다. </li><li> 드라이 아이스의 표본으로 금형을 놓습니다. 장착 매체가 동결하기 시작하면, 10 월 매체와 금형의 나머지 부분을 작성하고 그것이 완전히 얼어 보자. sectioning 전에 -80 ° C에서 최소 1 H 위해 금형 보관하십시오. 냉동 표본은 -80에서 여러 달 동안 저장될 수있다 ° C. </li></ol> 5. Sectioning 하트 <ol><li> 16 μm의의 절삭 크기, -24 ° C의 실내 온도와 -22 ° C.에서 시편의 온도와 그라 이오 스탯을 설정 </li><li> 함께 냉동 블록을 삽입합니다그라 이오 스탯의 표본과 블록의 바닥에 평행하게 절단 시작으로 방향을 수정합니다. </li><li> 한 블럭 최대 6 Superfrost 이상의 슬라이드를 준비하고 1에서 6을 이수 계. 조직에 도달할 때까지 절단 시작하고 razorblade와 시편 주위의 블록을 잘라. </li><li> 6을 구하려하는 것은 하나의 마음으로 복제, 슬라이드 1의 첫 번째 섹션, 슬라이드 2 번째 섹션, 슬라이드 3 번째를 차지 등 일단 슬라이드 6 여섯 번째 섹션을 배치, 슬라이드 1로 다시 시작 때까지 계속 모든 장기가 절단됩니다. 슬라이드 8에서 섹션의 두 행 (그림 3)를 수집합니다. </li><li> 상온에서 1 시간 슬라이드를 건조 보자. -20 ° C.에 단단히 닫힌 상​​자에 일년까지 그들을 저장 </li></ol> 6. 대표 결과 이 프로토콜에 따라 대표적인 심장 손상은 4 dpci에서 해부하는 내내 마음에 표시됩니다 (일 게시물 cryoinjury, 그림 2D-F). V를 위하여생체내에서 심근 조직을 isualize, 우리는 심장 관련 cmlc-2 발기인 11,12의 통제하에 EGFP와 핵 DsRed2을 표현 형질 전환 물고기를 사용했습니다. EGFP와 DsRed2 형광 신호의 부재는 혀끝의 - 측면 심실 벽을 따라 디스크 모양의 경색 영역을 demarcated. 조직의 세포 및 분자 분석을 수행하려면, 마음은 고정하고 그라 이오 스탯과 sectioned 있었다. 횡단하는 마음이 섹션의 연속 시리즈로 대표 슬라이드가 그림 3에 표시됩니다. 섹션은 다양한 방법 (그림 4)로 분석할 수 있습니다. 흉터 대 심장 중생의 범위를 결정하기 위해, 우리는 differentially 심장과 fibrotic 조직에게 9 레이블 산성 Fuchsin 오렌지-G (AFOG) 염색법을 사용 histological 분석을 수행했습니다. 유전자 발현 분석은 현장 하이브리드화 절차에 따라 달성했다 <suP&gt; 13. 마커 단백질의 분포를 감지하기 위해 특정 항체 9 immunofluorescence 분석을 적용. 다양한 염색법 절차의 결합은 심장의 재생 다음의 cryoinjury에 관련된 분자 및 세포 메커니즘 식별이 생깁니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig1.jpg" /> 그림 1. 성인 zebrafish에서 뇌실의 cryoinjury을 유도. 저온 탐침의 (A) 사진. (B) 성인 zebrafish는 최대의 복부 측면과 스펀지의 슬릿에 배치됩니다. 마음에 액세스하려면 (CF) 가슴 절개. (C) 피부와 근육을 통한 작은 커팅은 두 가슴 지느러미 (빨간색 선) 사이에 이루어집니다. (D) 가위는 빨간색 화살표를 따라 피부를 잘라 절개로 삽입됩니다. (E) 피부 아래, 은빛 hypodermis의 미세 층 (파란색 점선를 둘러싸고) 부드럽게 가슴에 액세스 열립니다. (F) 절개가로 전염됩니다포셉 및 박동 뇌실 (녹색 화살표)는 cryoinjury 위해 액세스할 수 있습니다. (사) 차가운 저온 탐침는 부드럽게 마음을 붙잡을 수있는 가슴에 삽입됩니다. (HJ) 하트 모음. (H) 깊고 긴 절개는 pericardial 캐비티에 액세스 가슴 아가미의 아치를 통해 이루어집니다. 두 개의 심장 구조는 볼 수 있습니다 bulbus arteriosus (흰색 화살표)과 뇌실 (녹색 화살표). (I) bulbus arteriosus은 집게로 누른 뱃속에서 꺼냈어요됩니다. (J) 전체 심장은 신체의에서 excised됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig2.jpg" /> 그림 2. 대표 제어 및 EGFP와 cardiomyocytes의 핵 DsRed2을 표현 성인 형질 전환 zebrafish에서 해부하는 cryoinjured 마음. (AC) 심장 손상되지 않은. () 암시야 조명은 뇌실을 보여줍니다 아트리움은 뇌실에 연결되었다 (V), bulbus arteriosus (BA, 흰색)와 밸브 (바닥). 전술 (B와 C) 형광 이미지<html> 그는 그대로 뇌실 디스플레이 EGFP와 cardiomyocytes의 DsRed2 표현. 사일 포스트 cryoinjury시 (DF) 하트 (4 dpci) (D) 암시야 조명은 디스크 모양의 경색을 (노란색 점선) 밝힌다. (EF) Cardiomyocyte 마커 EGFP와 DsRed2가 손상된 myocardium을 (점선를 둘러싸고) 나타냅니다 경색 영역에서 감지되지 않습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig3.jpg" /> 그림 3. 심장에서 Sectioning. 심장의 정상을 향한 마음 (1, 2, 빨강)을 (녹색 3과 4)의 하단부터 횡단하는 섹션의 그림으로 (A) 온 마음. (B) AFOG (산성 Fuchsin 오렌지-G) 물들일 연속 횡단하는 섹션의 시리즈와 슬라이드의 사진. 첫 번째 섹션 (1, 2, 빨간색 사각형) 심실 정점을 포함하고, 마음 (3, 4, 녹색 사각형)의 마지막 섹션 bulbus arteriosus 구성됩니다. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg &quot;/&gt; 분석의 그림 4. 예제 7 일 게시물 cryoinjury에서 심장 부분에서 수행. 오렌지의 () AFOG (산성 Fuchsin 오렌지-G) 염색법 레이블 건강한 근육 세포, 빨간색 파란색과 섬유소의 콜라겐을 포함하는 반흔 조직. (B) 심실 마이 오신 중쇄 (vmhc)의 원위치 하이브리드화에서 mRNA는 그대로 myocardium (블루 염색법)을 시각화. 부상당한 조직은 심장 유전자 성적 증명서 (빨간 점선)은없는 상태입니다. (C) Tropomyosin의 Immunoassaying (녹색)은 그대로 cardiomyocytes 아니라 손상된 조직을 (점선으로 둘러싸고) 레이블. DAPI (파란색) 얼룩이 모든 세포의 핵. (D) 그들의 핵에있는 유전자 분류 cardiomyocytes 명시적 DsRed2 (빨간색). DAPI (파란색)는 모든 핵을 표시합니다. 경색 영역 DsRed2-긍정 세포 (흰색 점선)이 포함되어 있지 않습니다.

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동물 실험 연구는 프리 부르의 분할한 수의과 사무실에서 승인되었습니다.

Cryoinjury는 극단적인 추위 14 정확한 응용 프로그램에 의해 조직의 제어 손상으로 정의됩니다. 직접 열 충격 단백질 파괴 의해​​ 플라즈마 막이 파열 세포내 유체 얼음 결정 형성하여 세포를 파괴합니다. 따라서 부상 세포는 apoptosis과 괴사 14 프로세스에서 죽어요. 이러한 세포 죽음의 메커니즘은 모두 심근의 경색 15 일 이후에 조직의 손실에 기여하기 위해 표시되었습니다. 따라서 cryoinjury는 심장 경색을 일으킬 수도 적합한 모델을 나타냅니다. 몇몇 연구는 생쥐, 쥐, 토끼 및 돼지 6,7 등 다양한 포유류에서이 잘 증명 방법을보고했다. zebrafish의 cryoinjury 프로토콜의 적응이 서로 다른 종 사이의 경색 응답에 대한 자세한 비교 논의를 가능하게합니다. 다른 두 그룹은 독립적으로 성인 zebrafish의 심장에 대한 cryoinjury 절차를 개발했습니다. 주요 차이점은 쉬르이다gery 방법, 도구의 종류와 적용 동결 시간. 곤살레스 - 로자 외.에 의한 연구에서는 심장막는 조직을 찢어 대신 삭감에 의해 개설되었다. 그들은 해동는 10 관측할 수 있었을 때까지 몇 초간 심장을 멈추게하기 위해 액체 질소에 미리 냉각 polyamid 튜브에 연결된 0.3 밀리미터 구리 필라멘트를 사용했습니다. 에 의한 연구에서는 Schnabel 외., 그 직경 2 mm의 뾰족한 끝부분이있는 20 밀리미터 길이의 드라이 아이스 원뿔 조각은 십초 8시 심장은 건드리지하는 데 사용되었다. 두 그룹은 myocardium의 죽음을 통해 심실 손상을 획득하였습니다. 우리의 방법의 장점은 더 포유류 시스템에서 관찰 초기 경색의 치료 반응을 모방한 것이었 콜라겐이 풍부한 흉터의보다 재현성 증착입니다. zebrafish의 cryoinjury 절차 중 중요한 단계는 기본적인 마음을 펑쳐링없이 피부와 pericardial SAC를 통해 절개를하고 있습니다. 제대로 performed 개의 수술은 약간의 출혈을 일으 킵니다. 넘치도록 출혈이 가위로 뇌실의 신성 모독이 펑크를 나타냅니다. 그러한 경우에는 동물 실험에서 철회되어야한다. 마음을 펑쳐링 피하기 위해, 가위의 포인트는 피부에 얕은 각도를 목표로해야합니다. 재현성 부상을 만들기위한 또 다른 중요한 측면은 최적의 정확한 기간 동안 뇌실의 추위 저온 탐침의 정확한 위치입니다. 너무 짧은 동결 시간은 거의 세포 죽음과 염증을 초래할 것입니다. 장기간 동결는 반면에, 동물의 향상된 사망으로 이어질 수있는 마음의 광범위한 손상을 입을 수 있습니다. 우리는 최적의 시간이 2cm 길이 성인 zebrafish를 위해 23-26초 사이 냉동 상태 범위에서 뇌실을 보유하는 것을 결정하고, 그것은 동물의 크기에 dependently 다를 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 매우 간단하고 빠른 속도이기 때문에, 어떤 실험적인 제한은 없습니다적절한 생물 학적 복제를 얻기 위해 동물의 충분한 수를 쓰는에 ations. cryosurgical 치료가 잘 동물들에게 용납된다. cryoinjury 후 다른 시간 지점에서 마음의 컬렉션은 재생 과정에서 후속 단계의 세부 특성화 수 있습니다. cryoinjured 마음의 실험 분석은 현장 하이브리드화에 의한 유전자 전사의 시각화, 2) immunofluorescent 염색법, 3에 의한 단백질 분포 감지) 다른 구조의 histological 이미징 1)을 포함할 수 있습니다. zebrafish의 심근 경색 후 주요 치유 과정을 이해하는 것은 재생 생물학 분야에 영향을 것입니다. 또한, 그것은 재생 의료에 소설 치료 접근법을 디자인하는 도움이 될 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 마이크로 해부 스프링 가위 </td><td> Roboz 외과 악기 유한 주식 회사 </td><td> RS-5602 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> 포름 알데히드 ~ 36% </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 47,630 </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 84,100 </td></tr><tr><td> 조직 - 테크 10월 화합물 </td><td> 사쿠라 Finetek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Superfrost 플러스 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 껍질 - 방향 일회용 임베딩 금형 - 잘린다 석고 본이 T8 </td><td> Polyscience 주식 회사 </td><td> 18,985 </td></tr></tbody></table>

induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury

포유류의 심장은 심근 경색의 하나로서 급성 부상에 따라 상당한 중생의 능력이다. 이와 대조적으로 urodele 양서류와 teleost 생선은 거의 없거나 전혀없는 삶 2,3 걸쳐 흉터가있는 심장 재생하는데 탁월한 능력을 보유합니다. 일부가 아닌 포유 동물 척추 동물은 4,5 잔여 조직에서 전체 기관을 다시 만들 수 있습니다 이유는 알 수 없습니다. 여러 종의 재생 반응 사이의 분자 및 세포의 차이를 이해하기 위해서, 우리는 심각한 부상을 일으킬도 비슷한 방식을 사용해야합니다. 포유류에서는 심장 수리를 연구하는 데 가장 자주 사용되는 모델은 cryoinjury 6,7 이후 관상 동맥 또는 조직 파괴의 결합 후 급성 국소 빈혈되었습니다. newts 및 zebrafish에있는 심장 중생은 주로 심실 꼭대기 2,3의 부분 절제술 후 연구되었습니다. 최근 여러 그룹 establ있다성인 zebrafish의 8-10의 cryoinjury 기법을 ished. 그것이 포유 동물과 비 포유 동물 종에서 얻은 결과의 비교 논의를 수 있기 때문에이 방법은 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 여기서는 cryoinjury 의해 zebrafish 뇌실의 재현성 디스크 모양의 경색을 유발하는 방법을 제시한다. 이 부상 모델 심실 벽 cardiomyocytes의 20 % 정도의 대규모 세포 죽음과 결과를 신속하게 냉동 - 해동 조직에 따라 달라집니다. 첫째, 작은 절개는 심장에 액세스하려면 iridectomy 가위로 가슴을 통해 만들어졌습니다. 심실 벽에 직접 23-25​​초 액화 질소에 precooled 스테인레스 스틸 저온 탐침을 신청하여 냉동되었다. 상온에서 심장, 물고기 물의 동결을 중지하는 것은 저온 탐침의 끝에 감소되었다. 절차는 물론 95 % 생존율과 함께, 동물에 의해 용납된다. 재생 과정을 특성화하기 위해 마음은 있었다cryoinjury 후 다른 일에서 수집된 및 고정. 그 후, 시편은 cryosectioning 임베디드되었다. 섹션과 슬라이드는 원위치 하이브리드화 및 immunofluorescence에 histological 분석 처리되었습니다. 이 사업은 zebrafish에서 재생 소성에 필요한, ​​그리고 심장 중생의 기계 장치로 새로운 통찰력을 제공하는 요소 중 우리의 이해를 향상시킵니다. zebrafish에있는 심장 중생의 개념 및 분자 이해 발달 생물학 및 재생 의학 모두에 영향을 미칠 것입니다.

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Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Zebrafish는 척추 동물에서 심장 중생의 메커니즘을 연구하기위한 귀중한 모델을 나타냅니다. 여기서는 cryoinjury를 사용하는 성인 zebrafish에있는 심장 경색의 유도를위한 프로토콜을 제시한다. 포유류의 infarcts에서 관찰하는 것과 비슷한 심실 벽의 20 % 이내 거대한 세포 죽음이 방법은 결과를.

성인 Zebrafish에서 심근 경색의 유도는 Cryoinjury 사용

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

induction-of-myocardial-infarction-in-adult-zebrafish-using-cryoinjury

Research

JoVE Journal

Medicine

21.9K 조회수.  University of Fribourg, Fribourg, Switzerland. Zebrafish는 척추 동물에서 심장 중생의 메커니즘을 연구하기위한 귀중한 모델을 나타냅니다. 여기서는 cryoinjury를 사용하는 성인 zebrafish에있는 심장 경색의 유도를위한 프로토콜을 제시한다. 포유류의 infarcts에서 관찰하는 것과 비슷한 심실 벽의 20 % 이내 거대한 세포 죽음이 방법은 결과를.