이 작품은 NHI R01 부여 KLV에게 수여 GM59690에 의해 지원되었다.

1. 초기 특성화 및 고려 사항 <ol><li> Biofilm 형성은 일반적으로 세포 밀도와 성장 속도에 의해 영향을받습니다. 따라서 성장 속도 (시간에 따른 광학 밀도 (OD)의 증가) 및 단순 성장 곡선과 세포 도금 assays를 수행하여 관심의 변형 (들)의 수율 (최종 휴대폰 번호)를 확인하는 데 필요합니다. 실험을 야생에서 결과를 해석하면 성장, 혹은 OD 및 휴대폰 번호 사이의 상관 관계의 부족 결함은 고려되어야한다. </li><li> 마이너 판 - 투 - 플레이트 편차가 biofilm 개발에 영향을 수 있으므로 주름 콜로니 형성을 평가했을 때 같은 접시 적절한 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함합니다. </li><li> 스포팅위한 최상의 조건​​, 즉 제어 및 관심있는 돌연변이 (들) 사이의 가장 뚜렷한 차이를 밝혀 이들을 식별합니다. 같은 다른 미디어 또는 온도 등 다양한 조건 하에서 액체 문화의 변종을 재배하고, 다양한 무대에이전에 야생의 성장 (지수 혹은 고정 상)의의. 스팟 10 적절한 미디어를 향해 다양한 세포 밀도의 문화의 μl, 그리고 식민지의 morphologies은 명백한 될 때까지 원하는 온도에 부화. </li><li> 엔드 포인트 분석 (예, 48 시간) 야생 후 미리 정해진 시점에 주름이 식민지 형성의 평가를 포함한다. 이 평가는 종자 유용 biofilm 형성에 전시 (또는 전시 제안하고 있습니다) 심각한 결함니다. </li><li> 시간 코스 분석은 일정 기간 (예, 매 시간) 이후의 야생을 통해 주름 식민지 형성을 평가합니다. 이 분석은 일정 기간 동안 주름이 식민지 형성 및 패턴 개발의 시작의 결정을 허용하여 biofilm 형성 세미 양적 평가를 허용합니다. 주어진 시간 코스에 대한 컬렉션 포인트의 실험과 숫자의 기간은 예비 실험에서 결정되어야한다. </li><li> 쉽게에 설정 후 야생 시간을 추적하려면최대 계산하기 imer. </li></ol> 2. V.에 주름 콜로니의 형태론의 현미경 평가 fischeri <ol><li> 접종 V. LB-소금 (LBS) 중형 13 (1 % [W / V] tryptone, 0.5 % [W / V] 효모 추출물 2 % [W / V] 나트륨 염화물, 50 MM 트리스-HCL [5 ML에 fischeri 세포 산도 7.5]) 28시 야간, 흔들림과 함께 필요한 경우 항생제와 부화를 포함한 ° C. 세포가 원하는 OD 600에 도달하기 전까지 아침에, 동일한 조건 하에서 신선한 LBS 매체와 부화 5 ML에 1:100 희석과 세포를 subculture (예 : OD 600 = 0.2 또는 0.5). </li><li> microfuge 튜브와 하나 잠깐 최대 속도 microfuge 세트의 원심 분리기로 문화의 피펫 1 ML. 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. 멸균 70% 인공 해수 중 1 ML (ASW) (35 MM MgSO 4 7H 2 O, 7 MM CaCl에 펠렛을 resuspending하여 잔류 미디어 및 세포외 구성 요소를 제거하는 세포를 씻으2 - 2 시간 2 O, 210 MM NaCl, 7 MM KCl)과 원심 분리를 반복. 70% ASW 1 ML에서 한물간 펠렛을 Resuspend. </li><li> 각 예제와 같은 600 nm의에서 OD가 추정 세포의 동일한 숫자를 포함하고 있는지 확인합니다. 추가 70% ASW보다 집중적으로 샘플을 diluting하여 필요한 조정을합니다. 예비 실험에서 다양한 초기 OD 값의 현장 문화는 변종이나 조건의 주어진 집합에 대한 최적의 시작 OD를 확인하십시오. 최상의 결과 V. 위해 얻을 수있다 반점은 약 0.2의 OD와 문화에서 생성됩니다 fischeri. </li><li> 필요한 경우 항생제를 포함한 LBS 플레이트쪽으로 한물간 세포의 10 μl를 정확 해요. 접시에 문화를 안보 때, 한천 표면 위에서 꾸준한 피펫 (손가락 포함)에 있는지 확인하십시오. 아니 각도로, 수직으로 정확하고, 현장의 균일한 분포를 위해 천천히 액체를 추출. 일반적으로 각 변형이 (접시 당 최대 6 곳) 접시에 한 번씩 목격되고 위트실험마다 H 여러 접시 (2-3). </li><li> 점박이 문화가 고르게 분산 상태를 유지하기 위해 자리가 인큐베이터에 플레이트를 이동하기 전에 건조하실 수 있습니다. 번호판을 반전 28에서 그들을 품어 ° C. </li><li> 접종에 따라 12~15시간에서 성장하고 자리 시간별 시작의 형태를 모니터링합니다. 우리는 카메라 첨부 (ProgRES C10 플러스)와 ProgRes CapturePro하고 관찰하고 문서화 식민지의 형태를하고 주름 식민지 형성의 시작과 진행을 평가하기 위해 ImageJ 소프트웨어 프로그램과 함께 해부 범위 (자이스 혈구 stemi 2000-C)을 사용합니다. </li><li> 이미지 위에서 캡처하는 동안 단계 2.5에 나열된 특정 설치의 경우 반점은 CL 1,500 EC 차가운 광원과 투명한 유리 단계를 통해 수렁에서 조명하고 있습니다. 이 설정은 영상 주름 식민지 개발을위한 이유 V. 최적입니다 fischeri 식민지는 (명소) 반투명입니다. </li><li> 세인트에 나열된 특정 장비의 부재에EP 2.5, 완전한 식민지 시청 가능하며 조절 광원과, 이상적으로, 연결된 카메라를 가지고있는 해부 현미경을 사용하여 모니터 주름 식민지의 형태. 필요한 경우, 디지털 카메라도 첨부된 카메라의 부재로 활용하지만 이것은 최적되지 않습니다 수 있습니다. </li><li> 최고의 주름 식민지 개발을 시각화하기 위해서는 개발 biofilms의 입체 형태가 분별이 될 수 있도록 세균성 식민지 밑에 반사의 조명 강도와 각도를 모두 조정할 필요가 있습니다. 발견 식민지와 식민지의 아키텍처 (주름) 명확히 구별할 수 있는지 등 주변의 한천 배경 사이의 강한 대비를 제공하는 최적의 조명 조건을 확인합니다. </li><li> 식민지 색상의 변경이 biofilm 형성하는 동안 발생할 수있는 경우에 반점이 식민지의 색상 또한 고려되어야한다. 표시하는 방법으로 조명 소스의 강도와 각도를 조정착색에 이러한 미묘한 변화. 적절한 설정이 달성되면, 실험 기간 동안 그들을 유지합니다. </li><li> 얼마나 시간이 경과 접종시기부터 주름이 군락 형성이 각 변형이나 컨디션에 시작되는 시간이 있습니다. patterning 및 3D 구조의 형성 (즉, 강선은 바깥쪽 가장자리에 형성 또는 &#39;파문&#39;는 중앙에 발생)가 없었던 이유는 첫째되는 시점으로 주름 식민지 형성의 시작을 정의합니다. 돌연변이 세포는 주름 식민지 형성의 시작 (예를 들어, 그림 2.)로 시간을 감소 또는 증가 발생할 수 있습니다. </li><li> 적절한 디지털 이미지를 캡처하여 주름 식민지 형성의 시작과 발전을 문서. 그것은 실험을하는 동안 이미지를 수집하는 경우 동일한 배율을 사용하는 것이 중요합니다. 현미경의 접안 렌즈에서 카메라의 후면에 위치한 레버를 사용하여 컴퓨터 화면으로보기를 전환합니다. 접안 렌즈 사이를 전환할 때그리고 컴퓨터 화면 시청은 전망을 조정하고 이에 따라 초점을 맞춥니다. </li><li> 이미징 점박이 배양하기 전에, 페트리 접시의 뚜껑은 일반적으로 가장 선명한 이미지를 제공하기 위해 제거됩니다. 점박이 문화가 단계 2.5 및 2.6에서 설명한 설정을 사용하여 뚜껑을 통해 몇 군데 수 있습니다 그러나, 이것이 단계는 선택 사항입니다. </li><li> 주름 식민지 형성의 시작에 따라 각각의 시점에서, 주름 식민지 개발의 패턴을 확인합니다. 아키텍처는 내부 밖에서 개발할 수도 있고,이 평가 인치 외부는 다른 변종이나 다른 조건 하에서 형성 biofilms를 구별하기위한 메커니즘을 제공합니다. </li><li> 각 시점에서 개발 식민지의 직경을 측정합니다. 이것은 수동으로 수행하거나, 디지털 관련 소프트웨어 프로그램을 사용하실 수 있습니다. 디지털로 할 경우, ProgRes CapturePro 소프트웨어 프로그램을 사용하여 먼저 실험에 사용된 특정 배율로 눈금 막대를 보정. 캡처된 각각의 이미지의 스케일 막대를 포함합니다. </li><li> ImageJ 소프트웨어 프로그램을 사용하여 식민지 직경을 계산하려면 각 이미지 파일을 엽니다. 다음과 같이 규모가 막대를 표준화 : 도구 모음에서 &#39;스트레이트 라인 옵션 &quot;을 선택하십시오. 동일한 길이와 너비 직선으로 임베디드 규모 표시줄을 입혀라. 레이블 탭에서 &quot;설정 규모&quot;를 선택 &quot;분석을.&quot; 그리고 &quot;확인&quot;을 선택, &quot;알려진 거리&quot;상자에서 (즉, 2mm로서 원래의 규모 표시줄에서 결정) 해당 길이를 넣습니다. </li><li> 현장을 가로질러 수평선을 삽입하려면 &#39;스트레이트 라인&#39;옵션을 사용하십시오. 분석 탭에서 &quot;법안&quot;을 선택합니다. 새로운 결과 창에서 계산된 길이가 제공됩니다. 현장 전반에 걸쳐 수직 라인을 삽입하여 두 번째 측정을 구합니다. 직경을 다시 계산합니다. 두 측정의 평균을 기록합니다. 그래프와 같은 엑셀과 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 각 시점에서 각 지점의 평균 직경. </li><li> 실험의 끝이 어느 특정 시점에서 때 또는 더 이상 없습니다 발생biofilm을 개발. 끝에 도달하면, 같은 파워 포인트와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 시간이 지남에 따라 패턴 개발을 시각화하기 위해 그림 (들)에 이미지를 통합. </li></ol> 3. 대표 결과 이러한 실험에서는 사용 V. 고체 한천 표면에 주름이 식민지의 발전을 평가하여 biofilm 형성을 연구하는 모델 생물로서 fischeri. V.의 Biofilm 생산 종자 40 H 내에서 광범위한 3D 아키텍처 fischeri 양식 식민지 (그림 1) 8,9,14. 시간에 걸쳐 검사하면 컨트롤 변형에 의한 주름 식민지 형성이 12만큼 일찍 시작하는 것이 명백한된다 H 포스트 접종 (특정 조건에 따라 다름) (그림 2) 9. 반대로, 대표적인 돌연변이에 의한 biofilm 형성은 약 16 H 포스트 접종 9까지 시작하지, 약 4 H에 의해 지연될 수 있습니다. 반복 하오이러한 실험 TS는 9이 평가는 세미 양적 만드는시기가 비교적 일관성 것을 제안했습니다. biofilm 형성의 두 번째 세미 양적 측정은 시간이 지남에 개발 식민지의 직경의 변화 이용한다. 다른 이름으로 그림. 3A는 대표 biofilm - 관할 발표했던 식민지를 형성하는 그 복잡 성과 biofilms을 구성하지 못하는 대표적인 변형에 상대적으로 직경이 증가. 이 두 가지 변종에 의해 형성된 콜로니 직경의 시간의 경과에 조심스럽게 측정은 biofilm-관할 콜로니의 크기가 biofilm - 부정적인 식민지보다 더 큰 비율로 증가 것으로 나타났다 및 종료 시점에 두 사람은 거의 2 일까지 다릅니다 - 배 (그림 3B). 대표 늦은 시간 또는 &quot;엔드 포인트&quot;식민지의 형태의 이미지가 자주 문학에 표시된 있지만 따라서, 추가, 세미 양적 데이터는 biofilm 결함에 대한 이해를 허용할 것이다 수령하실 수 있습니다.<img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> 그림 1. 엔드 포인트 분석. 이 수치는 V. 대표 (오른쪽) 이외의 biofilm - 성형 (왼쪽)와 biofilm - 성형 변종을 사용하여 엔드 포인트 분석의 예입니다 fischeri. 이러한 이미지는 40 H는 이후 야생에서 수집되었다. 이러한 이미지는 야생 형 V.으로 생성되었습니다 fischeri는 벡터 제어 (비 biofilm - 성형) 또는 설정 모리스 외., 2011에 대해 수집된 데이터의 rscS overexpressing 플라스미드 (biofilm - 성형) 및있었습니다 일부를 포함하는. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> 그림 2. 시간 코스 분석. 상단 패널의 biofilm - 유능한 제어의 흐름은 biofilm 형성을 대표하는 이미지가 포함되어 있습니다 V. 선택한 시간 코스 이상 fischeri. biofilm 형성의 개시는 12 H에 분명하다. 하단 패널은 대표 전을 포함V.의 돌연변이 변종의 mages biofilm 형성 16 H 이후의 접종시 시작으로 시간이 지남에 주름이 식민지 형성의 시작의 지연 (4 H), 전시 fischeri. 이러한 변종 사이의 미묘한 차이가 오직 이전 시간 지점에서 관찰하는 동안 40시간에서 변종이 biofilm 형성의 강도 및 patterning에서 비슷합니다. 이러한 이미지는 rscS overexpressing 야생 - 타입과 sypE 돌연변이로 생성된 V. fischeri 세포와 데이터의 줄 부분은 모리스 외 대해 수집된 집합., 2011. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> biofilm 형성의 반 정량 분석 그림 3. 콜로니 직경. V. 대표 biofilm - 성형 (위쪽 패널) 및 비 biofilm - 성형 (하단 패널) 변종에 의한 biofilm 형성 () 시간 코스 fischeri. biofilm - 성형 변형률이 큰 증가를 전시하고주의비 biofilm 형성 변형에 상대적으로 시간이 지남에 직경 인치 이러한 이미지는 야생 형 V.으로 생성되었습니다 데이터 rscS overexpressing 플라스미드 (biofilm - 성형) 또는 벡터 제어 (비 biofilm - 성형) 및있었습니다 부분을 포함 fischeri 모리스 외., 2011에 대한 수집 설정합니다. (B) 프로토콜에 명시된 바와 같이 이러한 데이터가 ImageJ와 엑셀 소프트웨어를 사용하여 생성된 패널 A에서 두 변종에 의해 시간의 경과에 식민지 직경의 증가의 그래픽 표현.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 작품에서 우리는 biofilm 형성을 사용하여 평가하는 세미 양적 방법을 설명 V. 모델 생물로서 fischeri. 특히, 우리는 고체 한천 표면에 시간이 지남에 주름이 식민지 형성 등 biofilm 형성과 발전을 모니터하는 카메라 첨부 파일이있는 해부 현미경을 활용. 이 프로토콜에서는, 우리는 일반적으로 주름 식민지 형성을 평가하기 위해 사용하는 방법 두 가지 구체적인 유형을 설명합니다. 첫 번째는 우리가 선택한 &quot;최종&quot;시점에 최종적으로 전체적인 3D 아키텍처, patterning, 그리고 더럽혀진 문화의 직경을 관찰 수있는 엔드 포인트 분석이다. 이러한 접근 방식은 biofilm 형성을 극적으로 결함을 초래할 돌연변이 변종 또는 조건을 평가하기위한 가장 유용합니다. 그러나, 이러한 방식은 선택된 엔드 포인트 전에 시간 지점에서 발생하는 많은 미묘한 차이를 구분하지 않습니다. 보다 긴밀하게 주름 식민지 형성을 모니터링하기 위해, 우리는 우리 w의 시작을 식별할 수있는 시간 코스 분석을 사용시간의 경과에 식민지 형성과 발전을 지켜을 rinkled. 이 접근법의 결과로 주름 콜로니 형성, 3D 건축 및 patterning의시기에 더 미묘한 차이는 확인할 수 있습니다. 우리는 biofilm 형성의 두 세미 양적 assays을 생성하기 위해이 시간 코스 분석를 사용했습니다. 첫째, 긴장이 3D 아키텍처를 개발하기 위해 시작되는 시간을 제어 계통의 비교할 수 있습니다. 우리는 동일한 조건 하에서 특정 돌연변이의 biofilm 형성의 지연 9 상당히 일관성있는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 그림 데이터 인치 2 돌연변이가 지속 biofilm 형성을 시작에서 4 H 지연에 대해 전시. biofilm 형성의 두 번째 세미 양적 법안은 주름 식민지 (장소)의 직경의 크기의 변화입니다. 우리는 (그림 3 주름 콜로니 직경이 점차적으로 종료 시점에서 2 배 차이에 대해 접근이 아닌 biofilm 식민지의와는 다른 것으로 나타났습니다 </strong&gt;)을 (모리스와 Visick, 게시되지 않은 데이터). 그것이 어떤 뮤턴트 다르게 동작합니다 가능한 남아 있지만 현재까지, 우리는 (되지 않은 데이터) (즉, 식민지 직경의 증가없이 biofilm 형성) 다른없이 한 표현형을 관찰하지 않았습니다. 실제로, 그것은 V. 대해보고되었습니다 식민지 직경에있는 상당한 증가에 약간 주름이 식민지 결과가 다른 15 없지만 것을 cholerae. 그럼에도 불구하고 시간이 지남에 따라 직경의 변화를 평가하는 것은 잠재적인 biofilm의 돌연변이 및 / 특성화에 투입하거나 개발 지연과 뮤턴트의 추가적인 양적 척도를 제공할 수 있습니다. biofilm 형성의 두 가지 대책 (시간 및 직경)의, 주름 식민지 형성의 시작을 결정하는 것은 현장의 직경을 결정하는 것보다, 더 많은 주관적 더 민감하지만. 그럼에도 불구하고 두 조치는 biofilm 연구에 매우 유용하지만, quantificatio으로 즉시 의무가 없습니다 표현형의 세미 양적 평가를 제공N. 발견 교양 assays를 수행하면 발견 변종이 배양해되는 환경 조건을 고려하는 것이 중요합니다. 주름 식민지 형성은 주로 양분 가용성, 온도 및 습도 등 다양한 환​​경 조건에 의해 영향을받습니다. 실험 사이의 다양성을 줄이기 위해서는 가능한 (즉 설정된 볼륨 한천 플레이트를 표준화하고 통제된 온도에서 culturing 발견 변종)가 이러한 조건을 표준화하는 데 유용합니다. 야생 실험 사이의 다양성에 대한 제어, 실험의 각 집합 내에서 해당 컨트롤 변종을 포함하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 이러한 assays에서 데이터를 해석하면, 그것은 주름 식민지 형성의 미묘한 차이 (예를 들어, biofilm 형성 또는 patterning 차이가 지연될)을 평가 특히 어느 한 실험에 여러 번 (3 +)을 수행할 필요가 있습니다. 이 프로토콜 중 일부 제한 사항은 다음과 같습니다 1) determin세포 성장에 결함을 가지고 있는지 ING가 어려울 수 있습니다 : 액체 문화에 세포의 성장은 정확하게 성장 고체 미디어 요금 및 불가 능할 수 있습니다 뭉쳐 있습니다 biofilm - 형성 세포의 성장의 정확한 결정을 반영하지 않을 수 있습니다; 2) 성장 결함있는 종자는 분석이 문제가 될 것이다; 3) 그것은 미묘한 biofilm의 phenotypes와 변종 사이의 직경 차이를 구별하지 못할 수도 있습니다 4) 동심 반지 성장하지 변종 위해 정확하게 측정할 수 없을 수도 있습니다 직경의 변화,이 실험적인 설정과 biofilm의 Z-치수를 측정 할 수 없어도), 6, 5) patterning이 biofilm 형성 동안 관찰할 수 있지만 거기에 결과 biofilm의 patterning을 수량 수있는 방법은 없다 . 이러한 제한에도 불구하고,이 프로토콜은 그럼에도 불구하고 주름 식민지 형성을 평가에 투입하는 수치 데이터를 얻을 수있는 수단을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 특정 이미지를 활용시스템은 주름 식민지 형성을 관찰하고 평가하는 (즉, 자이스 혈구 해부 현미경과 ProgRes CapturePro 이미징 소프트웨어). , 주름 식민지 형성의 시작을 감지하고, 따라서 시간 코스 방식으로 개발을 평가할 수있는 능력이 크게 해부 현미경의 사용을 통해 향상됩니다 여기서 설명 이미징 시스템은 강력하다. 이 기술을 사용할 수없는 경우에는 프로토콜은 줌 초점 간단한 디지털 카메라 등 다른 장비와 함께 사용을 위해 적응 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 주름 식민지 개발의 평가에 초점을 맞추고 있지만, 또한 박막 형성, 세포가 액체 문화에 정적으로 성장하는 때 개발 biofilm의 형태를 평가하기 위해 수정이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 biofilm 개발 중 점박이의 식민지로 특정 염료의 결합을 포함하여 biofilm 형성의 다른 지표를 평가에 유용합니다. 이들은 포함하지만, 그러한 콩고 레드와 calcoflu 같은 염료에 국한되지 않습니다또는 이것은 셀룰로오스, 16 세균성 biofilms의 일반적인 구성 요소에 바인딩할 수 있습니다. 또한이 프로토콜을 사용하기 위해 개발된 비록 V. fischeri는이 유기체에 한정되지 않고 있지만 이러한 바실러스 subtilis 4, 비브리오 cholerae 5, 장염의 비브리오균 6 및 녹농균 7, 모두 전시 주름 식민지 형성 등 여러 가지 생물에서 biofilm 형성을 연구에 일반화 될 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 또한 녹농균 18의 Myxococcus xanthus 17 성장과 항공 구조를 개발 중에 발생 patterning, 잠재적 등의 발달 패턴을 가지고 다른 식민지의 morphologies 공부를 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 미생물학과 biofilm 연구자에 대한 일반적인 사용하므로입니다.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 자이스 혈구 stemi 2000-C는 현미경 분석 해 봅시다 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> 45,505,300,000,000,000 </td><td> (루카스 현미경을 통해 얻은) </td></tr><tr><td> ProgRes C10 플러스 </td><td> JENOPTIK 광학 시스템 게엠베하 </td><td> 017953-602-26 </td><td> 카메라 부착 (루카스 현미경을 통해 얻은) </td></tr><tr><td> CL 1,500 EC 콜드 라이트 소스 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> 4355400000000000 </td><td> (루카스 현미경을 통해 얻은) </td></tr><tr><td> ProgRes CapturePro </td><td> JENOPTIK 광학 시스템 게엠베하 </td><td> 등록 카메라와 자유 소프트웨어 </td><td> 이미지 캡처를위한 컴퓨터 프로그램 </td></tr><tr><td> 이미지 J </td><td> NIH </td><td> 에서 무료 소프트웨어 :엘제이 / download.html &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> 직경 측정을위한 컴퓨터 프로그램 </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

Biofilms이나 세포외 기질에 캡슐 세포의 표면 부착 사회는 많은 박테리아에 대한 일반적인 라이프 스타일을 나타냅니다. biofilm 내에서 세균 세포는 종종 항생제 및 기타 환경 스트레스 1 ~ 향상된 저항을 포함하여 생리를 변경냅니다. 또한 biofilms는 호스트 - 미생물 상호 작용에서 중요한 역할을 재생할 수 있습니다. Biofilms 개인의 경우 세균 전환을 개발, planktonic 전지는 복잡한 다세포 공동체에게 2를 형성합니다. 실험실에서 biofilms는 특정 biofilm의 phenotypes의 발전을 평가하여 공부하고 있습니다. 일반 biofilm의 표현형은 단단한 한천 매체 3의 주름이나 주름이 많은 세균 콜로니 형성을 포함한다. 주름 식민지 형성 식별하고 특성 변경된 biofilm의 phenotypes을 전시 박테리아 변종을, 그리고 충격 biofilm 형성 그 환경 조건을 조사하기 위해 특히 간단하고 유용한 방법을 제공합니다. Wrinkled 식민지 형성은 이러한 비브리오 cholerae 5, 장염의 비브리오균 6, 녹농균 7과 바실러스 subtilis 4 및 그람 음성 세균과 같은 그람 양성 세균, 모두 포함한 박테리아의 다양한에서 biofilm 형성의 지표 역할을하고, 장염 fischeri 8. 해양 세균 V. fischeri는 호스트 식민지 동안 biofilms의 중요한 역할에 의한 biofilm 형성을위한 모델이되었다 : 제작한 biofilms V. fischeri는 하와이 꼬리 자른 오징어 Euprymna scolopes의 8-10 자사의 식민지를 추진. 중요한 것은, 체외에서 관찰 biofilm의 phenotypes는 V.의 능력과 상관 관계 fischeri 세포는 효과적으로 호스트 동물을 식민지 방법 : 종자가 증가 할 전시하면서 체외의 biofilm 형성을 위해 장애인 변종은 식민지 결함 9,11을 가지고biofilm의 phenotypes는 식민지 8,12위한 개선됩니다. V. fischeri 따라서 박테리아가 biofilm 형성 방법과 biofilms 영향을 미치는 호스트 식민지를 조절하는 메커니즘을 평가하는 간단한 모델 시스템을 제공합니다. 이 보고서에서 우리는 biofilm 형성을 사용하여 평가하는 세미 양적 방법을 설명 V. 모델 시스템으로 fischeri. 이 방법은 고체 한천 매체를 향해 정의의 농도와 볼륨에서 세균성 문화의 야생 신중을 포함, 더럽혀진 문화는 하나의 세균성 식민지에 대한 동의어입니다. 이 &#39;점박이 문화&#39;기술은 하나의 지정된 시간 포인트 (엔드 포인트 assays)에서 총 biofilm의 phenotypes을 비교하거나 식민지 직경의 biofilm 개발과 측정 시간 코스 assays를 통해 미묘한 biofilm의 phenotypes를 식별하고 특성을 위해 활용할 수 어느가 biofilm 형성에 의해 영향을받습니다. 따라서이 기법은 당, biofilm 형성 세미 양적 분석을 제공합니다주름 식민지 개발과 개발 구조를 간단하게 전체적인 형태 넘어 확장 특성의 상대적 크기의 타이밍과 patterning의 평가를 mitting.

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A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

우리는 biofilm 형성을 조사하기위한 간단한 세미 양적 방법을 제공<em&gt; 체외에서</em&gt;. 이 방법은-C 2000 타이밍 및 biofilm 형성의 패턴을 모두 모니터링하는 (카메라 부착 포함) 현미경 분석 해 봅시다, 등 주름 콜로니의 개발에 의해 평가 자이스 혈구 stemi 활용합니다.

주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

23.1K 조회수.  Loyola University Medical Center. 우리는 biofilm 형성을 조사하기위한 간단한 세미 양적 방법을 제공 체외에서. 이 방법은-C 2000 타이밍 및 biofilm 형성의 패턴을 모두 모니터링하는 (카메라 부착 포함) 현미경 분석 해 봅시다, 등 주름 콜로니의 개발에 의해 평가 자이스 혈구 stemi 활용합니다.

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A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

연구

생물학

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

메추라기 오리 키메라를 사용하여 두개 안면 개발에 종 - 특정 포스트 평가

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

소프트 한천 콜로니 형성 분석

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots located in Xinjiang Province, northwest China. To prevent high correlations among observations from the same sampling unit, we developed the model using a linear mixed-effects approach with random plot effect to account for stochastic variability. Various tree- and stand-level variables, such as indices for tree size, competition, and site condition, were included as fixed effects to explain the residual variability. In addition, heteroscedasticity and autocorrelation were described by introducing variance functions and autocorrelation structures. The optimal linear mixed-effects model was determined by several fit statistics: Akaike&#8217;s information criterion, Bayesian information criterion, logarithm likelihood, and a likelihood ratio test. The results indicated that significant variables of individual-tree basal area increment were the inverse transformation of diameter at breast height, the basal area of trees larger than the subject tree, the number of trees per hectare, and elevation. Furthermore, errors in variance structure were most successfully modeled by the exponential function, and the autocorrelation was significantly corrected by first-order autoregressive structure (AR(1)). The performance of the linear mixed-effects model was significantly improved relative to the model using ordinary least squares regression.

Mixed-effects models are flexible and useful tools for analyzing data with a hierarchical stochastic structure in forestry and could also be used to significantly improve the performance of forest growth models. Here, a protocol is presented that synthesizes information relating to linear mixed-effects models.

선형 혼합 효과 접근 방식을 사용하여 개별 트리 기초 영역 증분 모델 개발

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the surface and disaggregating the clumps, and analyzing the sample. Of the four steps, harvesting and disaggregation are the least studied but nonetheless critical when considering the potential for test bias. This article demonstrates commonly used harvesting and disaggregation techniques for biofilm grown on three different surfaces. The three biofilm harvesting and disaggregation techniques, gleaned from an extensive literature review, include vortexing and sonication, scraping and homogenization, and scraping, vortexing and sonication. Two surface types are considered: hard non-porous (polycarbonate and borosilicate glass) and porous (silicone). Additionally, we provide recommendations for the minimum information that should be included when reporting the harvesting technique followed and an accompanying method to check for bias.

This paper details methods that demonstrate three common biofilm harvesting and disaggregation techniques on two surface types, ruggedness testing of a harvesting method and minimum information to consider when choosing and optimizing harvesting and disaggregation techniques to increase reproducibility.

수확 및 분해 : 생물막 방법 연구에서 간과 된 단계

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

아시네토박터 생물막 형성 평가 및 생물막의 특성화

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

저자 스포트라이트: Acinetobacter Biofilm 정량화, 평가 및 시각화를 위한 포괄적인 프로토콜 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...