이 작품은 치과의 국립 연구소와 두개 안면 연구소 (NIDCR) F32 보조금 (DE021929) JLF 및 RAS에 NIDCR R01 부여 DE016402에 의해 투자되었다

1. 텅스텐 바늘을 준비한다 <ol><li> 로드가 구부러지지 않도록 와이어 커터를 사용하여 반으로 텅스텐 막대를 잘라. </li><li> 5 붕규산 유리의 3 / 4 파스퇴르 피펫의 테이퍼 말까지로드 실. </li><li> 유리로로드 고집의 약 3 / 4 떠나, 풀 총에 사용되는 접착제 지팡이입니다 &quot;핫 멜트 접착제&quot;(HMA)의 작은 구슬과 피펫 팁에 막대를 준수합니다. HMA는 신속하게 접착제를 태워 검은 색 연기가 발생하지 않도록주의를 복용, 알코올 불꽃에 녹아해야합니다. </li><li> 겸자의 쌍을 사용하여, 45 ° 각도에 도달 할 때까지 (약 1 / 4의 상단부로부터) 텅스텐로드의 선단을 굽혀. </li><li> 파스퇴르 피펫을 잡고, 프로판 토치의 불꽃에 텅스텐 막대의 끝 부분의 약 1 / 8을 배치합니다. 끝이 꾸준하고 화염에 정확히 수직으로 잡습니다. </li><li> 불꽃의 주사 바늘을 당겨 순간 tungs의 작은 오렌지 얼룩바늘의 오프 열 파리. </li></ol> 2. 스페 피펫을 준비 <ol><li> 곧 테이퍼 넘어 유리가 녹기 시작할 때까지 분젠 버너를 사용, 파스퇴르 피펫의 좁은 끝을 가열한다. 불꽃에서 제거하고 피펫이 봉인 될 때​​까지 끝을 당겨. 약 0.7 ~ 1.0 mm의 외경을 가지고 테이퍼 부분의 일부가 남아 있는지 확인합니다. 테이퍼에서 약 4cm 떨어져 밀봉 끝을 휴식. </li><li> 피펫의 넓은 (오픈) 끝 부분에 고무 튜브의 약 2 피트 (60cm)를 연결합니다. 공기는 파스퇴르 피펫의 테이퍼 부분을 통과하지 못하도록 보장하기 위해 고무 튜브의 타단에 불어. </li><li> 부속 연필 불꽃 토치 프로판 연료 실린더를 사용하여, 단지 테이퍼 개시 아래 피펫 한쪽 타원형 영역을 가열한다. 압력 소량의 (편지시의 시작을 말하는 데 필요한 압력의 정도 양에 고무 튜브를 매우 부드럽게 지속적으로 공기를 불어대화 수준의 R &quot;P&quot;). 유리가 한면에 부드러운되고 바깥쪽으로 버클을 시작하면 신속하게 불꽃에서 피펫을 제거하고 고무 튜브를 통해 하드와 꾸준한 타격. 이 유리의 가열 된 부분이 잘되는, 팝 수있는 소시지 모양의 거품을 형성하게됩니다. 거품이 너무 작은 경우, 용융 후 다시 유리 불고 시도. 유리의 마지막 열려있는 창 넓은 길이 (12.7 ㎜)의 0.5 (6.35 ㎜)에 0.25를 해결해야한다. </li><li> 테이퍼 단부 포인팅 위쪽으로 부드럽게 피펫 들어가는 유리 파편을 막기 위해 튜브를 통해 불고있는 동안 유리 폐기물 컨테이너로 버블을 긁어. </li><li> 프로판 불꽃을 사용하여 거품과 불 닦으 열린 창문의 양쪽의 나머지 가장자리를 구울 수 있습니다. 피펫의 축 녹지 않도록주의하십시오. </li><li> 다이아몬드 포인트 연필을 사용하여 창 (30 ㎜)의 약 1.25 피펫의 테이퍼 끝을 점수 및 팁을 해소집게로 피펫 구멍이 깨끗하게 (깨지거나 고르지 팁 폐기 피펫을) 절단되도록. </li><li> 집게를 사용하고 굴곡부가 수직 평면에 있도록 알코올 버너 화염의 가장자리는, 약 60 °의 각도로 끝에서 (9.5 mm)에 피펫 0.375의 좁은 부분을 구부릴 때 윈도우 개구 왼손 사용을 위해 오른손 사용 11:00에 대한 1시 위치에있다. 이 단계는 가장 초안없는 인클로저에 실시됩니다. </li><li> 불 닦으 해부 현미경 주류 불꽃을 사용하여 팁. 끝을 봉쇄 아니라 오프닝 라운드를 유지하고 굴곡없이 매끈하게하지 말아주십시오. </li><li> 고무 튜브의 1 (25 ㎜) 조각을 잘라 70 % 에탄올로 튜브의 조각을 살포하고, 창 개방이 완전히 덮여 때까지 피펫의 축에 튜브를 밀어 넣습니다. 이 스페 피펫의 &quot;격막&quot;로 작동합니다. </li><li> 라텍스 고무 2 ㎖ 전구를 배치피펫의 오픈 바닥에. 전구는 스페 피펫에 부정적인 압력을 유지합니다. </li><li> , 스페 피펫을 사용하여 연습을 현미경으로 다른에 표시된 지점에 하나의 배양 접시에 표시된 지점에서 직경이 약 100 ~ 200 ㎛, 크로마토 그래피 비즈를 전송합니다. </li><li> 스페 피펫을 청소하려면 바닥면 또는 거즈로 줄 지어 증류수와 유리 세제로 가득 키가 큰 비커에, 아래 팁, 고무 전구 및 장소 피펫을 제거합니다. </li></ol> 3. 계란 살균을 품다 <ol><li> 70 % 에탄올로 계란을 닦아 및 플라스틱 계란 트레이에 계란을 넣습니다. </li><li> 37.5 ° C와 85-87%에서 가열 된 인큐베이터에서 계란을 설정합니다. </li><li> 그들은 HH9.5, 메추라기와 오리 48 시간 동안 약 26 시간에 도달 할 때까지 알을 품다. </li></ol> 4. 창 계란 <ol><li> 내부 쉘 m에 구멍 않도록주의하면서, 집게로 계란의 상단에서 바깥 쪽의 작은 조각을 제거합니다embrane. </li><li> 1 인치 바늘로 18 G 주사기를 사용하여 계란의 좁은 끝 부분에 구멍을 찌르고 알부민의 약 1 ~ 2 ㎖의 철회. </li><li> 쉘에있는 구멍과 구멍 표시에 투명 테이프를 넣습니다. </li><li> 곡선 가위를 사용 (투명 테이프를 통해) 계란의 표면을 따라 &quot;창&quot;을 잘라. </li></ol> 5. 태아를 시각화 및 수술 준비 <ol><li> 유리 막대를 사용하여 부드럽게 배아 위에 중성 레드 소량 (행크의 BSS에서 0.02 g / ㎖)를 브러시. </li><li> 난황 막 컷 불꽃 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 배아에 당깁니다. </li><li> 창에 투명 테이프를 배치하여 계란을 다시 봉인. </li></ol> 6. 기증자의 배아에서 기증자의 조직을 분리 <ol><li> 기증자의 배아의 계란 창에서 테이프를 제거합니다. </li><li> 기증자의 배아 인접한 외배엽에서 신경 배를 잘라, SID 모두에 슬릿을(전술 한 바와 같이 제조 된) 화염 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용 신경관의 에스. </li><li> 그 후, 이식 원하는 전방 및 후방 수준에서 신경 튜브 가로 질러 및 신경 튜브의 나머지 부분에서 이식을 분리합니다. </li><li> 스페 피펫 또는 마이크로 피펫의 다른 유형을 사용하여 기증자의 배아에서 신경 배를 제거합니다. </li><li> 그런 다음, 호스트 계란 창에서 테이프를 제거하고 이식을받을 신경관의 영역에 인접한 호스트 배아 함께 기증자 신경 배를 배치 스페 피펫을 사용합니다. </li></ol> 7. 호스트 조직을 분리하고 기증자의 조직 이식 <ol><li> 기증자로 수행으로, 호스트 태아의 신경관에서 신경 배를 분리합니다. 기증자의 조직과 동일한 크기의 이식을 제거하기 위해주의하십시오. </li><li> 부드럽게 멀리 배아에서이 호스트 조직을 누릅니다. </li><li> 그런 다음, 무딘 텅스텐 바늘 또는 MI의 둥근 팁cropipette 부드럽게 적절한 전후면 및 dorso - 복부 방향을 유지, 기증자 신경 호스트 신경 튜브에 접어 이동합니다. 이식이 측면을 따라 자리 잡고 있습니다 있는지 확인하지만 찌를 또는 기본 조직에 손상되지 않도록해야합니다. 원래 방향 노트의 중립 레드에서 기증자의 조직 또는 차등 염색의 모든 비대칭을 추적 할 수 있도록하십시오. 또한 광 문서 수반 적출 조직뿐만 아니라 키메라와 도너 배아 즉시 수술 다음. </li><li> 호스트 배아가 건조의 흔적이있는 경우 멸균 식염수는 계란에 추가해야합니다. </li><li> 이제 조심스럽게 재 밀봉하고 알을 레이블을 조심스럽게 키메라 배아 분석을 위해 원하는 단계로 발전 할 수 습도가 높은 인큐베이터 (70-80 %)로 돌아갑니다. </li></ol> 키메라의 8. 컬렉션 <ol><li> 갓 만든 차가운 세라의 정착에 키메라 배아를 수집하고 즉시 RO에 배치해야합니다O / N 고정 용 4 ° C에서 cker. 이것은 안티 - 메추라기 항체와 메추라기 세포의 민감한 탐지를 위해 수 있습니다. </li><li> 유전자 발현은 RT-qPCR에를 통해 분석의 경우, 이전의 RNA 추출에 액체 질소에 직접 배아를 동결. </li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

신경 능선은 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 및 두개 안면 골격에 기여 연골 세포와 조골 세포 등 다양한 세포 유형으로 분화 과도 배아 세포 집단이다. 메추라기 오리 키메라 시스템에 신경 능선을 이식하면 두개 안면 골격의 발달을 조절하는 조직의 상호 작용과 신호 전달 경로에 대한 우리의 이해에 크게 기여하고있다. 그러나, 또한 평활근 세포, 지방 세포, 멜라닌 세포, 슈반 세포 및 신경 세포를 생성하는 신경 능선의 거대한 잠재력 주어진 메추라기 오리 키메라 시스템은 특히 줄기 세포 생물학의 급속한 발전과 함께 미래의 응용 프로그램에 대한 엄청난 잠재력을 가지고 재생 의료. 메추라기와 오리는 모두 상업적으로 사육 종 때문에, 상대적으로 저렴한 수정란의 준비가 공급 농장의 다양한 사용할 수 있습니다. 따라서,이 기술은 researc에 액세스 할 수 있어야합니다그녀는 예산 및 설비 공간의 넓은 범위 내에서 동작. 이 기술은 매우 강력하지만, 다음과 같은 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다. 다른 수술 기법과 마찬가지로, 메추라기 오리 키메라의 질과 생존은 연구원의 수술 기술에 의존하고, 따라서, 그 이용하여 마우스와 같은 다른 모델에 비해 실험 사이에 더 많은 상호 및 개인 내 변화가있을 것입니다 유전학. 또한, 재현성 및 각 이식의 성공에 기여 개발 및 개별 배아 단계의 비율의 변화도있다. 조류 배아는 탈수에 매우 민감하고 수술하는 동안 따라서 중요한 단계는 최소한으로 현미경, 낮은 시간을 가벼운 수준을 유지하는 등, 가능한 한 많은 테이프로 밀봉 달걀, 수술 후 인큐베이터에서 높은 습도 건조를 방지. 키메라의 생존, U의 측면에서이 비율은 나이가에게 수집 단계를 줄일 수 있지만 sually 사이 50-75%는 남아있다. 수술의 일반적인 4 ~ 6 시​​간 세션에서, 숙련 된 외과 의사가 15 키메라를 생성 할 수 있습니다. 이식의 성공은 또한 도구의 품질에 크게 의존한다. 좋은 도구는 더 일관성, 재생 가능한 결과로 이어집니다. 텅스텐 바늘을 만들기 위해 프로판 토치를 사용하는 것은 매우 날카로운 바늘이 될 수 있습니다. 그것은 불꽃의 크기를 제어하기 때문에 사용되는 토치의 종류는 큰 차이가 있습니다. 전해 샤프닝도 사용될 수 있지만,이 방법도 같은 날카로운 바늘을 제조 부근에 오지 않는다. 바늘을 똑바로 할 수 있도록하는 대신 스풀 와이어 텅스텐 막대를 사용하십시오. 스페의 마이크로 피펫은, 시간 소모적이고 어려운하게는, 조직 입금위한 이상적인 계기된다. 피펫은 서로 다른 크기의 구멍으로 정의 할 수 있고, 반복적으로 사용할 수 있습니다. 저기서을위한 중요한 요소조지아 스페의 마이크로 피펫은 배아의 표면에 끝을 만지기 전에 피펫에 약간의 액체를하는 것입니다. 접촉이 배아에 메 니스 커스 (meniscus)에 성공하면 유체의 일부가 유출됩니다. 약간 다이어프램에 최대시키는 것은 부드럽게 피펫에 기증자의 이식 조직을 빨아 반면 다이어프램에 누르면, 유체 및 이식 조직은 매우 정밀하게 배출 할 수 있습니다. 다이어프램에 긍정적 인 압력의 비트를 유지하는 것은 전송 중에 피펫의 끝에 기증자 이식 조직을 유지하고, 다이어프램에 약간의 추가 압력은 기증자의 이식 조직이 의도적으로 호스트에 배치 할 수 있습니다. 저장 및 살균 동안 스페 피펫의 보호를 위해, 넓은 끝에서 전구를 제거하고 조심스럽게 전구에 테이퍼 끝을 삽입합니다. 알루미늄 호일로 상단을 커버하고, 수술 전에 압력솥, 유리 시험관에 스페 피펫을 놓습니다. 여러 피펫은 다시가되면수술을 다시 멸균 할 ADY는 피펫을 반전 증류수 유리 세제의 동일한 솔루션에 종기에 약을 가열 한 후 증류수로 반복하여 씻어. 개별 튜브의 오토 클레이브 피펫. 그들은 어둡게 표시하고 뻣뻣한 될 때 다이아 프램 및 고무 전구를 형성하는 고무 튜브는 몇 가지 불임 후 대체 될 것이다. 이 프로토콜의 구성 요소의 대부분은 위험한 장비를 포함한다. 예를 들어, 스페 마이크로 피펫 만들기위한 과정을 3 화염의 종류뿐만 아니라 난방, 당기 불고, 굽힘, 절단, 유리 연마를 포함한다. 따라서, 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하는 고글 등의 안전을 증가하고 실험실 코트 중요하다. 또한, 많은 사람들이 고통, 또는, 계란 알레르기를 개발 계란을 취급 할 때는 항상 장갑을 사용 할 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에. 마음에 이러한주의 사항은, 메추라기 오리 키메라 시스템으로 전많은 미래의 응용 프로그램이 SA, 안전하고 효율적이며 비교적 접근 방법.

얼굴 골격은 외배엽과 내배엽 상피 층 1-11으로 둘러싸인 신경 능선과 중배엽 중간 엽으로 구성되어 여러 얼굴 프로세스의 성장과 융합에서 개발하고 있습니다. 각 프로세스 내에서 형태 발생 이벤트는 중간 엽과 주변 상피 12 ~ 16 사이의 뚜렷한 신호의 상호 작용에 의해 적용됩니다. 이러한 신호의 상호 작용 및 / 또는 하류 이펙터 변경은 질병 표현형에 기여하고 또한 두개 안면 골격 (17, 18)의 진화와 관련이있을 수 있습니다. 따라서 조직의 상호 작용의 타이밍과 성격을 해명하는 안면 골격의 발달과 진화 생물학에 대한 우리의 이해를 높이기 위해 큰 잠재력이있다. 조직의 상호 작용을 조사하기 위해 키메라 배아의 사용은 발달 생물학의 오랜 역사를 가지고 있습니다. 이 방법은 한스 스페 만과 그의 실험실에 의해 개척되었다다른 양서류 종의 배아 사이의 조직을 이식하여 배아 &quot;조직&quot;을 발견 한 사람. 스페 손으로 기술 전문 도구, 특히 스페 피펫 자신의 개발에 의해 보완 된 마이크로 수술 기법의 주인이었다. 빅토르 햄버거 스페의 노벨상을 주도 원래의 이식 실험을 수행 할 때, 이는 1920 년대 프라이 부르크에있는 한스 스페 만의 실험실에서 대학원생이었다. 햄버거는 1935 년 세인트 루이스의 워싱턴 대학으로 이동했을 때, 그는 실험 발생학 19 일 자신의 매뉴얼에 스페의 마이크로 피펫을 만드는 과정을 자세히 설명합니다. 드류 Noden 매사추세츠 애 머스트 대학에 다음 코넬 대학으로 이동 한 후, Noden는 제조와 메추라기 - 병아리 키메라를 포​​함하는 자신의 수술 이식 스페의 마이크로 피펫을 사용하여 계속했다. 1,972까지 워싱턴 대학에서 햄버거의 실험실에서 대학원생이었다. &amp;# 160;. 대학원생, 1995-1998 코넬에서 드류 Noden과 훈련 저자 (서식 슈나이더) 중 하나 스페의 마이크로 피펫을 만들기위한 다음과 같은 프로토콜이 햄버거 Noden 작성한 설명을 기반으로하고 만든 이후의 변경을 포함하는 동안 슈나이더. 두개 안면 개발의 연구에 특히 신경 능선 세포의 기여를 이해하기위한 메추라기 - 병아리 키메라의 사용은 르 Douarin 등 20에서 검토, 1970 년대 초에 Noden로와 르 Douarin에 의해 개척되었다. 이 방법은 광범위하게 많은 연구 및 많은 다른 연구자 1, 4, 5, 21-38에 의해 채택되었다. 성장과 메추라기와 병아리의 형태의 상당 비율은 세포의 운명과 혈통 추적 연구에 대한 그 안에 이식에 적합하다. 그러나, 메추라기와 여자 사이의 유사성, 형태 학적 변화는 산업사공여 세포로 uced는 해독하기가 어렵다. 반면, 다른 조류 키메라 시스템은 39-50 배아는 해부학 적으로 구별 할 메커니즘을 연구하는 방법으로 국내 오리를 포함했다. 보다 구체적으로, 메추라기 오리 키메라 시스템은 호스트, 그 반대의 도너의 효과 조건에 대한 여러 이점을 제공한다. 첫째, 메추라기와 오리 배아는 유전자 발현 (그림 1 A와 B)의 차동 도메인에 대한 시금에 의해 패턴 형성의 기증자 또는 호스트 고유의 메커니즘을 탐구하는 직접적인 방법을 제공 신체의 크기와 모양에서 구분된다. 둘째, 메추라기와 오리 배아는 메추라기 17 일 부화 오리 2​​8 일 부화와 성숙의 상당히 다른 비율이있다. 이식 된 신경 능선은 호스트 환경 내에서 극한 성숙 율을 유지하고, 따라서, 시간적 유전자 발현의 변화, 조직 상호 작용 histogenesis 및 형태 형성의 식별이 가능하다51-57. 마지막으로, 안티 - 메추라기 핵 항체 (PN ¢ Q)는 기증자와 호스트 세포 기여 재하 메추라기 세포에서 발현하지만 오리 세포에서 존재하는 단백질을 인식하여 서로 영구적으로 구별 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

키메라 배아의 생성은 세포의 운명, 조직의 상호 작용 및 조직 학적 및 척추 동물의 배아의 형태 개발에 종 특정 기여를 연구하는 광범위하고 강력한 방법입니다. 특히, 키메라 배아의 사용은 두개 안면 복합체의 종 특이 형태를 연출 신경 능선의 중요성을 설치했다. 여기에서 설명하는 방법은 매우 다른 두개 안면 형태로, 두 조류 종, 오리와 메추라기를 사용합니다. 이 방법은 크게 두개 안면 복잡한의 종 - 특정 패턴의 분자 및 세포 규제의 조사를 용이하게한다. 메추라기와 오리 키메라 배아 실험은 이미 신경 능선 매개 조직의 상호 작용과 두개 안면 골격, 근육, 및 외피에있는 종의 특정 패턴을 조절하는 세포 자율적 인 행동을 계시했다. 신경 능선 파생 상품의 다양성은 상당한 잠재력을 제안합니다척추 동물의 개발, 질병, 진화를 이해하는 메추라기 오리 키메라 시스템의 미래 응용 프로그램에 대한.

앞서 추가 분석으로, 이식의 효율을 정량 할 필요가있다. 조직 학적를 들어, 형태, 또는 유전자 발현이 조직 샘플에 대한 분석, 메추라기 세포는 36 바와 같이 Q ¢ PN 항체를 이용하여 면역 조직 화학 염색에 의해 감지해야합니다. RNA 분석의 경우, 그 조직에 종 특이 포스팅은 PCR-기반 전략 (58)을 사용하여 계산 될 수있다. 이식의 효과를 검증 한 후, 추가로 형태 학적 또는 분자 결과 측정은 키메라에서 평가 될 수있다. 기증자 신경 능선 세포와 적절한 histogenesis 및 두개 안면 복합의 형태 형성의 기초가 주변 호스트에서 파생 된 조직 사이의 상호 작용은 이전에 광범위하게 연구되고있다. 특히, 신경 능선 중간 엽 얼굴의 종 특이 형태 7, 13, 51, 59, 깃털 패턴 (52), 근육의 패턴 (56)을 지시 </s<html> 업&gt;, 및 연골 (53), 호스트 유전자 발현의 조절을 통해 57. 예를 들어, 신경 능선 중간 엽 시간적 BMP4 식 (55)를 조절하여 하악의 경우 뼈의 형태를 지시한다. 최근 조사는 초기 두개 안면 개발에서 발생하는 조직의 상호 작용을 중심으로했다. 이와 관련, 메추라기 오리 키메라를 활용 실험은 호스트 배아 형태의 경계를 결정하여 신경 능선 마이그레이션에 영향을 보여 주었다. 즉, 키메라 quck 배아 기증자 메추라기 신경 능선 세포가 오리와 같은 패턴 (그림 1D)의 호스트 오리 하악 아치로 마이그레이션합니다. 신경 능선 인구의 크기에이 호스트에 기여에도 불구하고, 기증자 신경 능선 메추라기와 같은 크기와 모양 (그림 1E)에있는 하악 골격을 생성하고 있습니다. 전자 1 &quot;FO : 콘텐츠 너비 =&quot; &quot;FO : SRC =&quot;6 인치 / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. 메추리 오리 키메라 시스템. 생성 (A) 메추라기와 (B) 오리 두개골 크기와 모양에 상당한 차이를 표시하고, 따라서, 이상적 (TOKIA 등. 56에서 수정) 두개 안면 개발을 연구하는 키메라 시스템을 사용에 적합합니다. (C) 실험 디자인 무대 일치 HH9.5 메추라기와 오리의 배아에서 일방적 인 키메라 배아 quck. 신경 배 메추라기 배아의 한쪽에서 제거하고 오리 배아에 이식 신경 배의 동등한 조각 후 제거되었습니다. (D) 메추라기 공여 세포 (녹색) 항 메추라기 항체 (Q를 사용하여 키메라에 따라 할 수있다 HH12 키메라 배아의 복부보기 참조) PN을 ¢. (F) HH38에서 quck 턱에서 메추라기는 메켈에게 기증자의 유래7;의 연골이 크고 만곡 반대측 오리 호스트 유래 메켈의 연골, 관찰보다 짧고 곧은입니다. 재판 토 키타 외., 개발. 바이오. 306, 377 (2007) 엘스 비어의 허가.

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Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

이 문서에서는 두개 안면 개발에 신경 능선 및 / 또는 기타 조직의 종 특정 기여를 테스트하기 위해 설계 키메라 배아를 생성하는 방법을 설명합니다.

메추라기 오리 키메라를 사용하여 두개 안면 개발에 종 - 특정 포스트 평가

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.8K 조회수.  University of California at San Francisco.  이 문서에서는 두개 안면 개발에 신경 능선 및 / 또는 기타 조직의 종 특정 기여를 테스트하기 위해 설계 키메라 배아를 생성하는 방법을 설명합니다. 

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Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Microfluidics를 사용하여 새로운 치료 응용 프로그램 개발

연구

생물학

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Chimeras의 생성에 대한 Medaka의 태아 및 세포 이식의 Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Craniofacial Mesenchyme의 Electroporation

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

압력 Myography를 사용 쥐과 저항 동맥의 기능을 평가

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...