본 연구는 과학기술정보통신부의 지원을 받아 한국식품연구원(KFRI)의 본과제(E0210702-03)의 지원을 받았다.

1. 세균 접종물의 제조
<ol><li>-80°C에서 보관된 글리세롤 스톡 바이알을 제거합니다.</li>
	<li>멸균 피펫 팁을 사용하여 바이알에서 박테리아 균주(2-10 μL)를 제거합니다. 참고: 이 프로토콜에는 아시네토박터 균주, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) 및 A. ursingii (24-1)가 사용됩니다.</li>
	<li>시판되는 혈액 한천 플레이트(5% 양의 혈액이 보충된 트립틱 대두 한천, 재료 표 참조)에 박테리아를 접종합니다. 알림: 영양 한천 또는 MacConkey 한천과 같은 다른 매체도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>간헐적으로 연소되는 멸균 루프를 사용하여 한천 표면을 줄무늬로 만들어 얇게 만듭니다.</li>
	<li>한천 플레이트를 인큐베이터에 거꾸로 놓고 30°C에서 밤새 20-24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>멸균 바늘로 박테리아 배양액의 단일 콜로니를 선택하고 5mL의 멸균 뇌 심장 주입액(BHI, 재료 표 참조)을 배양액과 함께 접종합니다.</li>
	<li>접종한 육수를 30°C의 진탕 인큐베이터에서 약 150rpm으로 20-24시간 동안 밤새 배양합니다.</li>
	<li>하룻밤 배양액 1mL를 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 실온(RT)에서 10분 동안 6,000× g 의 야간 배양액을 원심분리합니다.</li>
	<li>피펫으로 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>소용돌이를 사용하여 펠릿을 1mL 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>상온에서 10분 동안 6,000× g 으로 원심분리하고 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>소용돌이를 사용하여 멸균된 10배 희석된 BHI에 펠릿을 600nm에서 약 0.1의 광학 밀도로 재현탁시킵니다. 참고: 약 0.1의 광학 밀도는 약 107 CFU/mL에 해당합니다.</li>
</ol>2. 크리스탈 바이올렛을 이용한 생물막 정량화
<ol><li>멸균 폴리스티렌 96웰 플레이트의 각 웰에 200μL 접종물을 추가하고( 재료 표 참조) 가장 바깥쪽 웰 각각에 200μL의 탈이온수를 추가하여 내부 웰이 건조되는 것을 방지합니다15.</li>
	<li>200μL의 10배 희석된 BHI를 음성 대조군과 동일한 플레이트의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>플레이트를 25°C에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>피펫으로 상층액을 제거합니다. 참고: 멀티채널 피펫은 종종 여러 샘플에 더 편리합니다.</li>
	<li>각 웰에 300μL PBS를 조심스럽게 추가하고 피펫으로 상층액을 제거합니다. 참고: 멀티채널 피펫은 종종 여러 샘플에 더 편리합니다.</li>
	<li>2.5단계를 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>200μL 크리스탈 바이올렛 용액(1%)( 재료 표 참조)을 각 웰에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>2.4-2.6단계를 반복합니다.</li>
	<li>각 웰에 200μL의 절대 에탄올을 추가하고 RT에서 15분 동안 배양합니다. 위아래로 여러 번 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.</li>
	<li>각 웰에서 100μL 용출액을 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>마이크로플레이트 리더를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>흡광도가 2.0을 초과하는 경우 절대 에탄올에서 시료를 흡광도 2.0 이하로 적절하게 희석하고 2.11단계와 같이 측정한다. 그런 다음 관찰된 값에 희석 계수를 곱하여 샘플의 흡광도(최종 값)를 계산합니다.</li>
	<li>동일한 웰 플레이트에 있는 테스트 샘플의 각 웰 값에서 음성 대조군의 평균값을 빼서 샘플의 실제 흡광도를 계산합니다.</li>
</ol>3. 생물막 생존력 카운트
<ol><li>멸균 폴리스티렌 12웰 플레이트(15)의 각 웰에 1mL 접종물(1단계)을 추가합니다. 플레이트를 25°C에서 24시간 동안 배양합니다. 피펫으로 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>각 웰에 1.5mL 멸균 PBS를 조심스럽게 추가하고 피펫으로 상층액을 제거합니다. 각 웰에 1mL의 멸균 PBS를 추가합니다.</li>
	<li>장착된 셀 스크레이퍼를 사용하여 우물의 바닥과 벽 표면을 긁어냅니다.</li>
	<li>수확한 세포 현탁액을 9mL 식염수(0.85% NaCl)와 10-20개의 유리 비드가 들어 있는 멸균 플라스틱 튜브(10-1)로 옮깁니다( 재료 표 참조). 알림: 웰 바닥 표면에 남아 있는 잔류 생물막 파편을 수집하기 위해 10-1 튜브의 식염수를 사용하여 피펫으로 재현탁 및 이송할 수 있습니다.</li>
	<li>최대 속도로 10-1 튜브를 60초 동안 소용돌이칩니다.</li>
	<li>9mL 식염수(0.85% NaCl)를 최대 10-7까지 포함하는 다음 멸균 튜브(10-2)에 1mL를 옮겨 10배 연속 희석합니다.</li>
	<li>각 희석액에서 100 μL를 아시네토박터 한천( 재료 표 참조)에 펴 바르고 한천 플레이트를 30°C에서 24-42시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>각 플레이트의 일반적인 빨간색 콜로니 수를 10에서 250 사이의 범위에서 수동으로 계산합니다.</li>
	<li>아래 방정식을 사용하여 각 웰의 생물막에서 생존 가능한 세포의 수를 계산하십시오. 생존 세포 = 콜로니 수 × 희석 계수 × 10</li>
</ol>4. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 생물막 시각화
<ol><li>현미경 분석을 위한 멸균 96웰 플레이트의 각 웰에 200μL 접종물을 추가합니다.</li>
	<li>플레이트를 25°C에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>피펫으로 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>300μL 필터 멸균 탈이온수를 각 웰에 조심스럽게 추가하고 피펫으로 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>4.4단계를 반복합니다.</li>
	<li>필터 멸균된 탈이온수에 각각 10μM 및 60μM의 최종 농도로 희석한 SYTO 9와 프로피듐 요오드화물( 재료 표 참조)의 혼합물을 준비합니다.</li>
	<li>혼합물을 200 μL의 각 웰에 추가하고 어두운 곳에서 RT에서 20-30 분 동안 플레이트를 배양합니다.</li>
	<li>4.3-4.4단계를 반복합니다.</li>
	<li>여기 파장이 각각 488nm 및 561nm이고 방출 파장 범위가 499-535nm 및 568-712nm인 CLSM을 사용하여 바닥 표면 부착 생물막을 시각화합니다.</li>
</ol>

아시네토박터 생물막 형성 평가 및 생물막의 특성화

<ol>
	<li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections:+a+century+of+challenges.">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li><li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review.">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675 (2021).</li><li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter:+an+old+friend,+but+a+new+enemy.">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li><li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens:+Norovirus,+Clostridium+difficile,+and+Acinetobacter+species.">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix:+multitasking+in+a+shared+space.">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+microbial+&amp;#34;protective+clothing&amp;#34;+in+extreme+environments.">Biofilms: the microbial &amp;#34;protective clothing&amp;#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).</li><li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis:+a+review.">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li><li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii.">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li><li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells.">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714 (2022).</li><li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii:+genotype-phenotype+correlation.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849 (2019).</li><li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates.">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630 (2020).</li><li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157:H7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes.">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125 (2023).</li><li>Stepanovi&#263;, S., &#262;irkovi&#263;, I., Ranin, L., Svabi&#263;-Vlahovi&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface.">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li><li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville,+Tennessee.">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).</li><li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-attached+cells,+biofilms+and+biocide+susceptibility:+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection.">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li><li>Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment.">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).</li><li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157:H7.">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li><li>McConnell, M. J., Actis, L., Pach&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+human+infections,+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models.">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li><li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilms:+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties.">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li></ol>

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기술된 프로토콜을 사용하여, 다양한 정도의 아시네토박터 분리물의 생물막 형성을 측정하고, 시각화하고, 생물막에서 생존 가능한 세포를 추정하였다(도 1, 도 2 및 도 3).
이 프로토콜에서는 성장을 위한 30°C와 아시네토박터의 생물막 형성을 위한 25°C의 두 가지 다른 온도를 사용했습니다. 많?...

아시네토박터는 병원 내 감염을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 특히 의료 시설에서 인체 감염이 점점 더 많이 보고되고 있습니다1. 병원, 의료 시설 및 식품 관련 환경에 널리 퍼져 있습니다 2,3,4. 침대 레일, 침대 옆 탁자, 인공 호흡기 표면 및 싱크대와 같은 병원 표면을 포함한 환경에서 장기간 생존할 수 있습니다4. 환경 표면에서의 이러한 지속성은 아시네토박터4의 병원 감염에 기여하는 중요한 요인 중 하나일 수 있습니다.
생물막은 미생물 생명체의 한 형태이며 살아있는 미생물 세포와 세포의 세포외 고분자 물질(EPS)로 구성된 미생물 매트릭스입니다5. 미생물 세포는 매트릭스에 내장되어 있으며 종종 열, 염분, 건조, 항생제, 소독제 및 전단력과 같은 환경 스트레스에 매우 강합니다 6,7.
아시네토박터는 표면에 생물막을 형성할 수 있으며, 이는 병원 표면을 포함한 환경 표면에서 생존 연장에 기여하고 항생제 치료에 대한 내성을 향상시키는 데 기여할 수 있음을 시사합니다 8,9. 또한 아시네토박터의 생물막 형성은 인간의 임상 결과와 밀접한 관련이 있을 수 있다8. 따라서 아시네토박터 균주의 생물막 형성성은 환경 생존 및 인간 감염을 예측하는 지표 중 하나가 될 수 있다 8,10.
표면 부착 생물막은 정량화하고 시각화하여 생물막 형성성을 평가할 수 있습니다. 표면 부착 생물막을 정량화하기 위해, 생물막은 일반적으로 크리스탈 바이올렛과 같은 생물막 염색 염료에 의해 염색되고, 염료는 용액에서 용출되고 광학 밀도11에 대해 측정된다. 생물막의 시각화는 생물막 형성성을 평가하는 또 다른 좋은 접근법이다11. 형광 염료를 사용하여 특이성을 사용하는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 시각화 방법은 SEM12,13과 같은 다른 기술에 비해 생물막 형태를 특성화하는 데 더 유용할 수 있습니다.
생물막에서 생존 가능한 세포는 생물막에서 생존 가능한 세포의 수를 추정하기 위해 계수될 수있다 11. biofilms에서 끼워넣어진 생존 가능한 세포는 분리되고, 묽게 되고, 한천 격판덮개에 퍼지고, 배양되고, 열거됩니다. 세포의 수가 많을수록 전염성 투여량을 충족시킬 가능성이 높기 때문에 세포 수13,14와 관련된 감염 가능성과 같은 생물막에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다.
이 기사에서는 (1) 표면 부착 생물막을 정량화하고, (2) 생물막에서 생존 가능한 세포를 계산하고, (3) 아시네토박터의 CLSM을 사용하여 생물막을 시각화하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 아시네토박터 분리물의 생물막 형성성을 평가하고 이들의 생물막을 특성화하는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td>Polystyrene 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1.10493.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Agar Base Plate</td>
			<td>KisanBio</td>
			<td>MB-B1005-P50</td>
			<td>Growth media for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Acinetobacter</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>AC092</td>
			<td>Selective plate for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V5265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L10316</td>
			<td>SYTO9 and propidium iodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO NanoQuant</td>
			<td>Biofilm measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Glass Plating Beads</td>
			<td>RBC</td>
			<td>RG001</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>89621</td>
			<td>Microplate intended for CLSM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification, viability assessment, and visualization strategies for acinetobacter biofilms

아시네토박터는 병원 내 감염을 일으키며 생물막 형성은 병원 환경과 같은 건조한 표면에서 생존에 기여할 수 있습니다. 따라서 생물막 정량화 및 시각화는 아시네토박터 균주가 병원 내 감염을 일으킬 가능성을 평가하는 중요한 방법입니다. 마이크로플레이트 표면에 형성되는 생물막은 부피와 세포 수 측면에서 정량화할 수 있습니다. 생물막 부피는 크리스탈 바이올을 사용하여 염색하고, 세척하고, 에탄올을 사용하여 탈염한 다음, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 가용화된 염료를 측정하여 정량화할 수 있습니다. 생물막에 묻힌 세포의 수를 정량화하기 위해 세포 스크레이퍼를 사용하여 생물막을 긁어내고, 식염수에서 수확하고, 유리 구슬의 존재 하에서 격렬하게 교반하고, 아시네토박터 한천에 퍼뜨립니다. 그런 다음 플레이트를 30°C에서 24-42시간 동안 배양합니다. 배양 후에, 빨간 식민지는 biofilms에 있는 세포의 수를 추정하기 위하여 열거됩니다. 이 실행 가능한 계수 방법은 혼합 종 생물막에서 아시네토박터 세포를 계수하는 데에도 유용할 수 있습니다. 아시네토박터 생물막은 형광 염료를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 현미경 분석을 위해 설계된 상업적으로 이용 가능한 마이크로플레이트는 생물막을 형성하는 데 사용됩니다. 그런 다음 바닥 표면에 부착된 생물막을 SYTO9 및 프로피듐 요오드화물 염료로 염색하고 세척한 다음 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 시각화합니다.

Acinetobacter is known to cause nosocomial infections, and its human infection, especially in healthcare facilities, is increasingly reported1. It is widespread in hospitals, healthcare facilities, and food-associated environments2,3,4. It can survive for a long period in environments including hospital surfaces such as bed rails, bedside tables, the surface of ventilators, and sinks4. Such persistence on environmental surfaces may be one of the significant factors contributing to the nosocomial infections of Acinetobacter4.
Biofilm is a form of microbial life and is a microbial matrix composed of live microbial cells and extracellular polymeric substances (EPS) from the cells5. The microbial cells are embedded in the matrix and are often highly resistant to environmental stresses such as heat, salts, dryness, antibiotics, disinfectants, and shear forces6,7.
Acinetobacter can form biofilms on surfaces, suggesting that it may contribute to extended survival on environmental surfaces, including hospital surfaces, and enhanced resistance to antibiotic treatment8,9. In addition, the biofilm formation of Acinetobacter could be highly associated with human clinical outcomes8. Therefore, the biofilm formability of Acinetobacter strains could be one of the indicators in predicting environmental survival and human infections8,10.
The surface-attached biofilms can be quantified and visualized to assess biofilm formability. To quantify surface-attached biofilms, the biofilms are normally stained by biofilm-staining dyes such as crystal violet, and the dyes are eluted in solution and measured for optical density11. Visualization of biofilms is another good approach to assess biofilm formability11. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) visualization method employing specificity using fluorescent dyes could be more useful to characterize biofilm morphology compared to other techniques such as SEM12,13.
The viable cells in biofilms can be counted to estimate the number of viable cells in biofilms11. The viable cells embedded in biofilms are detached, diluted, spread on agar plates, incubated, and enumerated. Because the higher number of cells is likely to meet the infectious dose, it can provide more detailed information on biofilms, such as infection potentials associated with the number of cells13,14.
This article presents step-by-step protocols to (1) quantify surface-attached biofilms, (2) count viable cells in the biofilms, and (3) visualize the biofilms using CLSM of Acinetobacter. The presented protocols describe the methods to assess the biofilm formability of Acinetobacter isolates and characterize their biofilms.

저자 스포트라이트: Acinetobacter Biofilm 정량화, 평가 및 시각화를 위한 포괄적인 프로토콜 

Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략

Biofilms are composed of live microbial cells and are difficult to remove from the surfaces. Acinetobacter strains commonly found in our environment, causing nosocomial infections, are also known to form biofilms on surfaces. So, we aim to develop methods to both quantify and visualize Acinetobacter biofilms.Our protocol provides a simple and easy method to quantify and visualize the biofilms of Acinetobacter. The viable number of cells inside the biofilms is quantified by using the viable count method. Our research findings reveal that the naturally-existing Acinetobacter vector strains have quite varying potentials for biofilm formation.Also, there will exist distinct morphological differences within the various biofilms. This paved the way for research focusing on the causes of such a large variation among Acinetobacter strains.

프로토콜에 따라, 원래 부엌 표면에서 분리된 아시네토박터 분리물의 생물막을 폴리스티렌 96웰 플레이트에 형성하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 염료를 에탄올에 용해시키고 생물막 질량을 측정했습니다(그림 1). biofilms의 수는 OD 0.04에서 1.69 (숫자 1)에 배열하는 긴장에 매우 따라서 변화했습니다. Stepanović et al.16에 의?...

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이 프로토콜은 접종물의 준비, 크리스탈 바이올렛 염료를 사용한 마이크로타이터 플레이트의 생물막 정량화, 생물막의 생존 가능한 수 및 아시네토박터의 생물막 시각화에 대해 설명합니다.

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

생물막은 살아있는 미생물 세포로 구성되며 표면에서 제거하기가 어렵습니다. 우리 환경에서 흔히 발견되는 아시네토박터 균주는 병원 감염을 일으키며 표면에 생물막을 형성하는 것으로도 알려져 있습니다. 따라서 우리는 아시네토박터 생물막을 정량화하고 시각화하는 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다.당사의 프로토콜은 아시네토박터의 생물막을 정량화하고 시각화하는 간단하고 쉬운 방법을 제공합니다. biofilms 안쪽에 세포의 생존 가능한 수는 생존 가능한 조사 방법을 사용하여 정량화됩니다. 우리의 연구 결과는 자연적으로 존재하는 아시네토박터 벡터 균주가 생물막 형성에 대한 매우 다양한 잠재력을 가지고 있음을 보여줍니다.더구나, 각종 biofilms 내의 명백한 형태학적인 다름이 존재할 것입니다. 이는 아시네토박터 균주 간의 큰 변이의 원인에 초점을 맞춘 연구의 길을 열었습니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

1.4K 조회수.  Korea Food Research Institute. 생물막은 살아있는 미생물 세포로 구성되며 표면에서 제거하기가 어렵습니다. 우리 환경에서 흔히 발견되는 아시네토박터 균주는 병원 감염을 일으키며 표면에 생물막을 형성하는 것으로도 알려져 있습니다. 따라서 우리는 아시네토박터 생물막을 정량화하고 시각화하는 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다.당사의 프로토콜은 아시네토박터의 생물막을 정량화하고 ?...

비디오: 저자 스포트라이트: Acinetobacter Biofilm 정량화, 평가 및 시각화를 위한 포괄적인 프로토콜 

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

연구

생물학

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation  

To begin the process of bacterial inoculum preparation, collect 2 to 10 microliters of the bacterial strain from the vial, using a sterile pipette tip, and inoculate a commercially-available blood agar plate with it. Using a sterile loop, streak the agar surface, thinning it out with intermittent flaming. Incubate the prepared agar plate in an upside-down position at 30 degrees Celsius for about 20 to 24 hours.Next, select a single colony of the bacterial culture with a sterile needle and inoculate five milliliters of sterile BHI broth with this culture. Incubate the inoculated broth in a shaking incubator at 30 degrees Celsius at a speed of 150 rotations per minute for about 20 to 24 hours. Then transfer one milliliter of the culture to a sterile micro-centrifuge tube and centrifuge at 6, 000 g and room temperature for 10 minutes.Following centrifugation, discard the supernatant. Add one milliliter of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, to the pellet, and re-suspend it using a vortex. Centrifuge the re-suspended pellet at 6, 000 g for 10 minutes at room temperature and discard the supernatant.This time re-suspend the resulting pellet in sterile, tenfold-diluted BHI broth using vortex. Ensure to achieve an optical density of around 0.1 at 600 nanometers.

아시네토박터 생물막 형성을 위한 박테리아 접종물의 제조

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet  

To begin, add 200 microliters of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 96-well plate. Then add 200 microliters of deionized water into the outermost wells to keep the inner wells from drying out. Incubate the 96-well plate at 25 degrees Celsius for 24 hours.Following incubation, discard the supernatant in each well using a pipette. Carefully add 300 microliters of PBS to each well and remove the PBS again by using the pipette. Add 200 microliters of 1%crystal violet solution to each well before incubating the plate at room temperature for 30 minutes.Then after dispensing 200 microliters of absolute ethanol in each well, leave the plate for 15 minutes at room temperature. Ensure thorough mixing by pipetting the contents in each well up and down repeatedly. Using a microplate reader, measure the absorbance of the wells at 595 nanometers to determine the biofilm mass.The number of biofilms varied greatly depending on the strains, ranging from an optical density or OD value of 0.04 to 1.69 All of the Acetobacter isolates, except for A.bouvetii, formed biofilms, while A.radioresistens formed a weak biofilm. A.junii and A.baumannii formed moderate biofilms, and A.pittii and A.ursingii formed strong biofilms.

아시네토박터 Crystal Violet을 사용한 생물막 정량

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count  

Begin by adding one milliliter of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 12 well plate. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours. Then, remove the supernatant using a pipette.Carefully add 1.5 milliliters of sterile phosphate buffered saline or PBS to each well, and again, remove the supernatant with the pipette. After adding one milliliter of sterile PBS to each well once more, use fitted cell scrapers to scrape off the bottom and wall surfaces of the wells. Transfer the harvested cell suspension to a sterile plastic tube marked as 10 to the negative one containing nine milliliters of saline and 10 to 20 glass beads.Vortex the tube for 60 seconds at maximum speed. Next, perform a tenfold serial dilution by transferring one milliliter of the cell suspension from the previous tube to another sterile tube marked 10 to the negative two containing nine milliliters of saline solution. Continue this process of serial dilution up to tube 10 to the negative seven.Spread 100 microliters from each dilution onto separate acinetobacter agar plates. Incubate the agar plates at 30 degrees Celsius for 24 to 42 hours. Then count the number of typical red colonies on each plate manually, considering those within the range between 10 and 250.All the acinetobacter isolates except for A.bouvetii had cells equivalent to seven to eight log CFU per well in their biofilms. While A.bouvetii had a much lower cell number at 4.4 Log CFU.

아시네토박터 생물막 생존력 계수 평가

Acinetobacter Biofilm Visualization by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

Begin by adding 200 microliters of bacterial inoculum into each well of a sterile 96-well plate prepared for microscopic analysis. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours before removing the supernatant with the pipette. Next, carefully add 300 microliters of filter-sterilized deionized water into each well.Remove the supernatant using a pipette once again. In another tube, prepare a diluted mixture of SYTO 9 and propidium iodide and filter-sterilized deionized water to the respective desired final concentrations. Then add 200 microliters of the mixture into each well and incubate the plate for 20 to 30 minutes at room temperature in a dark setting.Confocal laser scanning microscopy revealed that biofilm formation significantly varied depending on the strains. A substantial amount of biofilm was found in Acinetobacter junii, Acinetobacter baumannii, and Acinetobacter ursingii with distinct biofilm morphologies.